通心络与阿托伐他汀、阿司匹林联合应用对apoe-小鼠动脉粥样硬化的影响

通心络与阿托伐他汀、阿司匹林联合应用对apoe--小鼠动脉粥样硬化的影响

动脉硬化（as）是心脑血管疾病的主要病理基础。脂质代谢异常和炎症反应对as病变的发生和肿瘤的形成起着重要作用：1）。降脂类他汀药和抗血小板聚集药阿司匹林均具有一定的抑制AS炎症反应的作用［2－3］,是目前AS患者使用最广泛的两种药物。通心络是近年来临床上广泛用于防治心脑血管病的中成药,具有内皮保护和稳定易损斑块的作用,可通过调脂、抗炎、抗氧化等多重作用机制发挥抗AS的作用［4］,且可以有效改善阿司匹林抵抗［5］,增强他汀降脂效果,疗效互补［6］。上述3种药物在心脑血管疾病的防治中各有特长,作用互补。近年来有人提出固定剂量的联合用药即polyp-ill的策略［7］,长期预防用药,可以达到防治疾病的效果。基于上述研究,有学者提出阿司匹林(A)、通心络(T)、他汀(S)联合应用防治心脑血管疾病的“金三角”方案(ATS),并取得明显的临床疗效［8］。但是该方案对ApoE－/－小鼠AS病变的影响研究国内报道甚少。因此本研究着重从脂质代谢和炎性反应角度探讨该方案抑制AS的作用,揭示3种药物联合应用时的疗效优势。1高脂饲料的组成与膜组as1.1动物ApoE－/－小鼠140只,8周龄,♂,体质量20~22g,北京大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(京)2006-0008。同遗传背景C57BL/6J小鼠20只,8周龄,♂,体质量20~22g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2006-0009。饲养在河北以岭医药研究院药理屏障实验室,光照12h·d－1,温度20℃~23℃,相对湿度40%~60%。1.2药物通心络超微粉(Tongxinluo):由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成,1.46g生药/g超微粉,石家庄以岭药业股份有限公司,批号20101016);阿托伐他汀(立普妥):20mg/片,7片装,大连瑞辉制药有限公司,批号:031711k;肠溶阿司匹林片:100mg/片,100片装,拜耳医药保健公司提供,批号:018110303。1.3主要试剂与仪器TC、TG、HDL、LDL试剂盒,(北京九强生物);高敏C-反应蛋白(hs-CRP)试剂盒(南京建成);兔抗鼠胞间黏附分子(ICAM-1)、血管细胞黏附分子(VCAM-1)及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)多克隆抗体(SantaCruz);7080型全自动生化分析仪(日本日立);WellscanMK3型全自动酶标仪(芬兰LabSystemsDragon);凝胶成像分析仪(美国Biorad)1.4方法1.4.1造模与分组给药方法140只ApoE－/－小鼠随机分为模型组(AS)、阿托伐他汀组(ATO)、阿司匹林组(ASP)、通心络组(TXL)、ATO联合ASP组(A+A)、3药联用低剂量组(ATS-L)及高剂量组(ATS-H),每组20只,均连续给予高脂饲料［9］(热量组成:碳水化合物20.1%,脂肪59.8%,蛋白质20.1%)。同时选取同遗传背景C57BL/6J小鼠20只,作为正常对照组(CON)。其中ATO组以6.0mg·kg－1·d－1灌胃(拟临床人用量40mg·d－1);ASP组以25mg·kg－1·d－1灌胃(拟临床人用量150mg·d－1);TXL组以1.5g超微粉·kg－1·d－1灌胃(拟临床人用剂量4.56g生药/d);A+A组以ATO6.0mg·kg－1·d－1加ASP25mg·kg－1·d－1灌胃;ATS-L组以ATO3.0mg·kg－1·d－1加TXL1.5g·kg－1·d－1加ASP12.5mg·kg－1·d－1灌胃;ATS-H组以ATO6.0mg·kg－1·d－1加TXL1.5g·kg－1·d－1加ASP25mg·kg－1·d－1灌胃;CON组和AS组以等体积的生理盐水灌胃,12周后,禁食,常规处死,进行检测。1.4.2主动脉病理形态观察实验末,处死小鼠,左心室灌流PBS,心耳下方切开小鼠心脏,分离主动脉根,10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色观察血管病理形态变化。1.4.3血清脂质成分测定实验末,禁食12h,1%戊巴比妥腹腔麻醉小鼠,眼眶后取血,4℃,3000r·min－1,离心10min,取上清分装,酶比色法测定血清TC、TG、LDL、HDL水平。1.4.4血清hs-CRP测定取分装血清,双抗夹心ELISA法测定hs-CRP水平,操作严格按照试剂盒说明进行。1.4.5Westernblot主动脉ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表达实验末,麻醉取血处死小鼠,左心室灌流PBS,自主动脉起始部仔细解离主动脉至腹主动脉的髂动脉分叉处,液氮保存。取血管约0.1g,提取总蛋白后,Nanodrop2000分光光度计蛋白定量,SDS-PAGE分离蛋白质,半干转膜后,含5%脱脂奶粉的TTBS封闭2h,加入TTBS稀释(1∶500)的一抗溶液/β-actin(1∶1000)4℃,过夜。脱色摇床上用TT-BS室温洗膜3次,每次10min。加入TTBS1∶10000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育2h。TTBS洗膜同上,化学发光法检测蛋白条带。照相保存,用ImageJ软件分析条带灰度值。1.5统计学处理采用SPSS17.0统计软件,计量资料以ue0af±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两间比较采用LSD法检验。2各组小鼠血脂指标比较2.1各组小鼠主动脉病理改变比较CON组:动脉内膜光滑完整,壁薄,管腔未见狭窄及脂纹斑块。AS组模型组内皮脱落,呈不连续缺失,内皮下及中膜大量泡沫细胞堆积,管腔狭窄及斑块形成明显;各用药组上述病理损伤均可见不同程度的减轻,其中ATS-H组病损明显减轻,泡沫细胞数量明显减少,斑块明显消退,优于模型组及其他用药组(Fig1)。2.2各组小鼠血脂水平比较与CON比较,AS组血清TC、TG、LDL均明显升高(P<0.01),HDL明显降低(P<0.01);与AS组比较,除ASP组外,其余各用药组TC、TG、LDL均明显降低(P<0.01),HDL-C均明显升高(P<0.01),其中TXL降低TC、TG、LDL,升高HDL水平与ATO、A+A作用相当(P>0.05),ATS-L、ATS-H组在降低TC、TG、LDL,升高HDL方面能力明显优于单用ATO、TXL及A+A组(P<0.05,P<0.01),而AST-H在降低TC、LDL,升高HDL方面优于ATS-L组(P<0.05)(Tab1)。2.3各组小鼠血清hs-CRP水平比较与CON组比较,AS组血清hs-CRP水平明显升高(P<0.01);与AS组比较,各用药组均能不同程度的降低hs-CRP水平(P<0.05或P<0.01),其中ATO、ASP、TXL3组间hs-CRP水平无明显差异(P>0.05),A+A及ATS-L组hs-CRP水平均明显低于ATO、ASP、TXL3组(P<0.05),但均高于ATS-H组(P<0.05),见Fig2。2.4各组小鼠主动脉组织ICAM-1、VCAM-1、MCP-1蛋白表达比较与CON组比较,AS组小鼠主动脉ICAM-l、VCAM-l、MCP-1蛋白表达明显上调(P<0.01);与模型组比较,各用药组上述指标的蛋白表达均有不同程度的下调(P<0.05或P<0.01),其中ATO、ASP、TXL组上述蛋白表达无明显差异(P>0.05),A+A及ATS-L组上述蛋白表达均明显低于ATO、ASP、TXL3组(P<0.05或P<0.01),但均高于ATS-H组(P<0.05),见Tab3,Fig2。3对as治疗的效果ApoE-/－小鼠由于缺乏载脂蛋白E使低密度脂蛋白代谢障碍,易于沉积管壁,因而可自发形成AS病灶,其AS病理形态较其他动物模型更接近于人类［10］,目前已成为国内外研究AS发病机制和干预措施较理想的动物模型。本研究采用高脂诱导ApoE－/－小鼠建立AS模型,结果显示经高脂喂饲12周后,模型组血清TC、TG、LDL水平均明显升高,HDL水平明显降低,HE染色显示主动脉内皮剥脱、内皮下有大量泡沫细胞聚集、斑块形成明显;本研究结果显示通心络可明显降低血清TC、TG、LDL水平,升高HDL水平;与阿托伐他汀、阿司匹林联用不仅可增强调脂疗效,明显降低AS致病因素;同时还可有效改善AS病理损伤,延缓AS斑块的形成,起到综合调治效应。AS是内皮损伤后的炎症反应及在此基础上的损伤-修复过程已得到证实［11］。研究表明［12］,C反应蛋白(CRP)是AS炎症反应中的敏感性标志物,不仅在预测心血管事件的发生和预后方面价值较高,同时也是AS的致病因素,诱导内皮细胞VCAM-1、ICAM-1等黏附分子表达及MCP-1的分泌［13］。MCP-1对单核细胞有趋化和激活作用,介导单核细胞向内皮下迁移［14］,VCAM-1、ICAM-1则可触发内皮细胞与多种白细胞、单核细胞的黏附,从而启动或加速AS的发展［15］。本实验中模型组小鼠血清hs-CRP水平明显升高,同时主动脉ICAM-1、VCAM-1、MCP-l蛋白表达明显上调,提示hs-CRP启动VCAM-1、ICAM-1及MCP-l蛋白表达在主动脉粥样硬化过程中发挥了重要作用;本研究结果显示通心络、阿托伐他汀及阿司匹林干预后均能不同程度地降低血清hs-CRP水平,下调ICAM-1、VCAM-1、MCP-l的表达,减轻AS炎性反应,这与文献报道基本一致［16