新生鼠心肌细胞培养过程技巧方法

一、材料与设备（一） 实验动物出生后1-4天SD乳鼠15只。（二） 实验试剂低糖DMEM、胰酶（含EDTA）、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank,s液。0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。培养液：培养液（DMEM，新生牛血清，青链霉素）。（三） 器械与仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿（共2套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织）、100ml广口瓶两个（分别装碘酒和酒精棉球）、500ml烧杯、250ml锥形瓶、15ml和50ml的离心管，磁力搅拌器和搅拌子（或者水浴振荡器）、150-200目尼龙筛网和针式滤器。二、实验流程（一）实验步骤将胰酶用D-Hank,s液配成0.06%的浓度，并放置于37°C水浴中温育好。解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's液中。重复以上过程。取材完毕后，撤掉取材的手术器械。注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。用第二套手术器械进行下列操作。用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中（或者其它合适容器中，视个人习惯），加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10ml，加上塞子，放在37C水浴中（可以用一个消毒的500ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。打开磁力搅拌器电源，预先将水温调节到37C），调节转速至60rpm左右，消化15min（务必保证水浴温度恒定在37C，并且消化时间不超过15min）。或者，如果采用的是水浴震荡器的话，不用加搅拌子，直接放在水浴震荡器中消化亦可，转速和消化时间相同。从水浴中取出锥形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血红细胞和成纤维类细胞。加入10ml新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液几次，机械分散细胞（组织消化后会成为粘稠的胶体状），注意：不要过分吹打，否则会导致组织过度消化，37°C水浴搅拌再消化10-15min；如果乳鼠数目少（比如5、6只的时候），消化时间可以减少为5-10min，否则很容易消化过度。上述消化处理的同时，往一支50ml的一次性无菌离心管中加入20ml预冷的含10%血清的培养液，并放置冰台上。消化处理之后，小心移出上清转至上述加有培养液的离心管中，第一次消化收集的分离出的细胞，第一次消化结束后；继续第二次消化，余下的组织块加入10ml新胰酶继续消化。重复第5步消化步骤，直至剩余少许组织块为止，一般消化4-5次可以消化绝大多数的组织块（不含弃去消化液的那次）。第1、2次含细胞的消化液放在一根离心管中，过180目筛网后，一起离心；第3、4次含细胞的消化液放在一根离心管中，过180目筛网后，一起离心。最后，分别用8ml含20%血清的培养液重悬两管细胞，接种到一个75cm2的塑料培养瓶中，放置在培养箱中1.5小时后，取出，弃贴壁细胞（主要是成纤维细胞和内皮细胞），将未贴壁的细胞悬液取出，台盼篮拒染法计数后，加入培养液调整细胞浓度为5-6X105个/ml，接种到目的培养器皿中。一般不用加BrdU，如果培养时间长（发现成纤维细胞也极少），可以加入0.1mmol/mlBrdU（Sigma）以阻止成纤维细胞增殖。加了BrdU，心肌细胞搏动的持续时间会更长。接种后24小时，用温的培养基或者平衡盐液轻轻冲洗培养的心肌细胞一次，以去处未贴壁的细胞（部分细胞会在24小时后贴，结果很多细胞重叠生长），再更换培养液，即可。可以按照实验需要在培养48h或72h后施加处理因素。（二）实验结果心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在24h左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好，DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充。鉴定的最简单的办法就是搏动与否，注意：当搏动比较微弱的时候，在10倍物镜下可能看不到搏动，换成20或40倍的物镜可能能观察到。检验操作是否合格的最好的办法就是看心肌细胞的纯度和搏动能力。另外，心肌细胞表达肌动蛋白，可以作为鉴定，但不是唯一的特征性指标，因为平滑肌细胞也表达。三、经验总结（一） 新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。大量观测表明，选择广3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想。其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。（二） 消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用。消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或II以及透明质酸酶。透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用。胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏。胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I。文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1g?L，我们使用的为0.8g?L。胶原酶最好现用现配。（三） 消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感。消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测。消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1）转速一般控制在60~80r?mij左右。（2）每次消化的时间须结合消化酶浓度确定。（3）将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织。（4）适宜温度为35〜37°C。（5）当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化。（四） 接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率。接种细胞的绝对数量应经精确计算。一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量。例如，如作形态学观测，六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1X105〜2X105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5X105~6X105个。（五） 细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象。因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态。接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上，避免细胞向培养孔的中央集聚。此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染。（六）对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。漠脱氧尿苷（bromodeoxyuridine,BrdU）可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长。改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90%以上的心肌细胞。（七） 换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液。这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实。此外，去血清后可用ITS和0.1g?LBSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响。（八） 抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：（1）获取心脏时避免剪破消化道。比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。（2）如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。（3）对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。（九） 培养液pH值