色谱分析法基本理论课件

5—1

概述5—2色谱过程及常用术语5—3色谱法基本理论第五章色谱分析法基本理论AnIntroductiontoChromatography5—1概述第五章色谱分析法基本理论5—1概述一、色谱法定义、实质和目的意义1、定义：是一种物理或物理化学的分离、分析方法。是基于混合物各组分在固定相、流动相两相中吸附、分配等作用的差异而实现分离，再逐个进行定性或定量分析的方法。2、实质：分离3、目的意义：实现多组分混合物的分离分析5—1概述一、色谱法定义、实质和目的意义1、定义：是5—1概述1、1906年由俄国植物学家Tswett创立（植物色素分离）

二、色谱法的由来色带固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

属于液固色谱概念：固定相流动相色谱柱5—1概述1、1906年由俄国植物学家Tswett创5—1概述2、现在：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析固定相——除了固体，还可以是液体流动相——液体、气体、超临界流体等色谱柱——各种材质和尺寸被分离组分——不再仅局限于有色物质二、色谱法的由来和发展5—1概述2、现在：一种重要的分离、分析技术二、色谱5—1概述三、分类流动相固定相类型液体固体液-固色谱液相色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气相色谱气体液体气-液色谱超临界流体超临界流体色谱1、按两相分子的聚集状态分5—1概述三、分类流动相固定相类型液体固体液-柱色谱分配色谱：利用组分在固定液中分配系数的不同吸附色谱：利用组分在吸附剂上吸附能力的差异离子交换色谱：利用组分在离子交换剂上的亲和力大小差异尺寸排阻色谱：利用大小不同的分子在多孔固定相中选择渗透性的不同5—1概述2、按固定相的固定方式分三、分类填充柱色谱毛细管柱色谱微填充柱色谱纸色谱（PC）薄层色谱（TLC）薄膜色谱（TFC）平面色谱3、按分离机制分柱色谱分配色谱：利用组分在固定液中分配系数的不同5—1色谱法简单分类5—1概述三、分类色谱法简单分类5—1概述三、分类5—1概述四、色谱法的特点及发展趋势1、优点：“三高”、“一快”、“一广”1）高选择性：可将性质相似的组分分开2）高效能：反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果3）高灵敏度：10-11~10-13g，适于痕量分析4）分析速度快：几~几十分钟完成分离，一次可测得多种样品5）应用范围广：气体，液体、固体物质对未知物分析的定性专属性差，需要与其他分析方法联用（GC-MS，LC-MS、GC-FTIR、SFC-MS、HPLC-UV、TLC-UV等）2、缺点：3、发展趋势：5—1概述四、色谱法的特点及发展趋势1、优点：“三高5—2色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程二、有关概念5—2色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程5—2色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程、分离原理和特点1、色谱过程：是物质分子在相对运动的两相间“分配”平衡的过程。实现色谱操作的基本条件：（1）必须具备相对运动的两相（固定相、流动相）（2）混合物中，两个组分的“分配”系数K

不等，则被流动相携带移动的速度不等——差速迁移，而被分离。5—2色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程、分离原理和特点1“分配”系数的微小差异→吸附能力的微小差异微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出吸附能力强的组分后流出以吸附色谱为例：过程：吸附（固定相）→解吸（流动相）→再吸附→再解吸……“分配”系数的微小差异→吸附能力的微小差异以吸附色谱为例：过一、色谱过程、分离原理及特点2、色谱分离特点

1）不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等→提供了分离的可能性2）各组分沿柱子扩散分布→峰宽→不利于不同组分分离3、色谱分离原理色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异（“分配”系数的不等），平衡分配可定量地用分配系数和分配比（容量因子）来表示。分配系数不等是分离的前提。5—2色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程、分离原理及特点2、色谱分离特点3、色谱分离原试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相进入检测器，检测器将各组分的浓度（或质量）的变化转换为电压（或电流）信号，由记录仪记录下来，所得到的电信号强度—时间曲线，即浓度（或质量）—时间曲线，称为流出曲线，即色谱图。色谱峰对应某物质。二、常用术语1、色谱流出曲线（色谱图）5—2色谱流出曲线及有关概念试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相进入检测器，检测器将各组2、基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。反映仪器（主要是检测器）的噪音随时间的变化（噪音-时间曲线）。3、色谱峰流出曲线上的突起部分，即组分流经检测器所产生的信号。包括：峰高/峰面积（定量）、峰位（tR，定性）、峰宽（衡量柱效）4、拖尾因子（tailingfactor，对称因子）衡量色谱峰的对称性。T

=

W0.05h

/2d1W0.05h

为0.05倍峰高处的峰宽；d1为峰极大至峰前沿之间的距离。5—2色谱流出曲线及有关概念色谱峰包括正常峰（对称峰，T=0.95—1.05）和非对称峰（不正常色谱峰）[前延峰（T

<0.95）、拖尾峰（T

>1.05）]d12、基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。5—2色5、保留值（tM、tR、tR’、VM、VR、VR’）（色谱定性参数）5—2色谱流出曲线及有关概念1）保留时间（单位：min，S或cm）（与流速有关）A、保留时间tR：某组分从进样开始到在色谱柱后出现浓度极大点时所需时间。（是色谱法定性的基本依据）B、死时间tM：分配系数为0的组分即不被固定相吸附或溶解的组分（不保留组分）的保留时间。

C、调整保留时间tR’

=tR

-

tM

（组分在固定相中的保留时间，实验条件（温度、固定相等）一定，tR’仅决定于组分性质）5、保留值（tM、tR、tR’、VM、VR、VR’）（色2）保留体积（与流速无关）A、保留体积VR

VR

=

tRFc

Fc：流动相的流速（mL/min）B、死体积VM

VM

=

tM

Fc

[固定相颗粒间所剩余的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间、检测器空间]C、调整保留体积VR’

VR’

=VR

–

VM=tR’Fc

3）相对保留值r2,1（

）：是色谱系统的分离选择性指标

r2,1

=tR2’/

tR1’

=VR2’/VR1’

=K2/K1仅随柱温、固定相以及流动相变化，当柱温、固定相、流动相不变时，该值与柱径、柱长、流动相流速无关。2）保留体积（与流速无关）6、色谱峰峰高、峰面积及色谱峰区域宽度（1）峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示（2）峰面积：某色谱峰曲线与基线间包围的面积，以A表示（3）色谱峰区域宽度：是描述色谱流出曲线的另一重要参数，反映了柱效的高低，区域宽度越窄，柱效越高，三种表示方式：1）标准差σ：0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2）半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽度（单位：min，cm），

W1/2

=

2.355σ3）基线宽度W：即峰宽，指色谱峰拐点上的切线在基线上的截距。

W

=

4σ

=

1.699W1/2定量6、色谱峰峰高、峰面积及色谱峰区域宽度定量总结：1）根据峰数，可以判断样品所含组分的最少个数。2）根据保留值（tR、VR），可进行定性分析。3）根据峰高或峰面积，可进行定量分析。4）色谱峰区域宽度，是评价柱效的依据。5）两峰间的距离，是评价两相选择是否合适的依据。总结：7、分配系数在一定温度和压力下，达到分配平衡时，K

=

CsCm组分在固定相中的浓度g/mL组分在流动相中的浓度g/mL1）样品从流动相进入固定相，很快在两相达到分配平衡。2）在流动相推动下瞬间打破平衡又瞬间达到新的分配平衡，即为动态平衡。3）样品正是在分配平衡—溶解—分配平衡循环往复达到分离测定目的。4）在给定条件下，同一物质K

相同，不同物质K

不同，从而出峰先后顺序不同，即保留时间不同，达到分离。5—2色谱流出曲线及有关概念7、分配系数K=CsCm组分在固定相中的浓度g/mL组5）K

适合多种机理吸附色谱：吸附平衡常数分配色谱：分配系数离子交换色谱：交换常数6）K

取值

大—在固定相中粒子数多，组分在固定相停留时间长—后出峰

小—在固定相中粒子数少，组分在固定相停留时间短—先出峰K

值由组分、固定相和流动相的热力学性质决定，是组分的特征常数。与两相性质和温度有关，与两相体积、柱管性质及使用仪器无关。K↑，tR↑，组分后出柱K

=

0，组分不保留K→∞，组分完全保留5）K适合多种机理K值由组分、固定相和流动相的热力学性质一、色谱过程、分离原理及特点k

=

VsVm

=

K

msmm

=

组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量Cs*VsCm*Vmk

=

K*VsVm固定相的体积8、保留因子/容量因子（分配比）与分配常数的换算关系：保留因子与保留时间的关系：k

=

tR

=

tM(1+k)tR

=

tM(1+KVs/Vm)tR

-

tMtM当色谱柱或薄层板一定时，Vs与Vm一定；流速、温度一定，tM一定，tR主要取决于分配系数K，K大，tR大。在实验条件一定时，tR主要取决于组分的性质，可用于定性。流动相的体积5—2色谱流出曲线及有关概念一、色谱过程、分离原理及特点k=VsVm=Kmsm例：关于保留因子的计算习题：在某色谱柱上A组分流出需要10min，组分B流出需要20min，而不溶于固定相的物质C流出需要2.0min，分别计算：A、B组分在柱中的保留因子。例：关于保留因子的计算习题：色谱分离前提→各组分分配系数不等注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K

不等1）组分一定，K

不等的前提A、固定相和流动相改变B、T

改变2）色谱条件（s，m，T）一定时，K一定→tR一定色谱分离前提→各组分分配系数不等注：应选择合适分离条件使得难9、分离度（resolution，R）又称分辨率给定色谱柱对两种溶质分离程度的量度。是指相邻两峰峰顶间距离与两峰基线宽度平均值的比值（衡量色谱分离条件优劣的参数）；涉及色谱过程热力学因素和动力学因素。设色谱峰为正常峰（峰形对称且满足正态分布），且W1

W2

=4若R

=

0，峰间距

tR=0，两峰完全重合；R

=

1，

tR=4，两峰分离度可达98％；R

=

1.5，

tR=6，两峰离度可达99.7％；可视为完全分离《中国药典》规定R

≥

1.5可作为两组分分离的指标9、分离度（resolution，R）又称分辨率设色谱峰为10、等温线与色谱峰形的关系等温线：指在一定温度下，某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时，以组分在固定相中浓度CS为纵坐标，在流动相中浓度Cm为横坐标得到的曲线。CS

=

f

(Cm)意义：1）其形状是重要的色谱特征之一。2）反映了在一定温度下，吸附剂对溶液中某组分的吸附能力。CsCm色谱曲线等温线凸形主要控制溶质量，防止拖尾凹形拖尾峰前延峰结论：控制溶质的量，减少拖尾！！10、等温线与色谱峰形的关系CsCm色谱等温线凸形主要控5—3色谱法基本理论色谱法是利用混合物中各组分在两相中K

值的不同而进行分离。要想使各组分实现有效的分离：

一、必须使两峰相距较远二、必须使峰型很窄5—3色谱法基本理论色谱法是利用混合物中各组分在两相中与组分在柱中的行走速度和扩散有关，研究如何选择最佳色谱条件以提高柱效属于动力学问题，为此提出了速率理论。。如何使两峰相距较远：峰间距的大小由组分的分配系数来决定，研究如何改善组分在两相间的分配属于热力学问题，为此提出了塔板理论。如何使峰型很窄：与组分在柱中的行走速度和扩散有关，研究如何选择最佳色谱条件以一、塔板理论假想：色谱柱每个H高度内有一块塔板，共有若干块塔板，组分在每块塔板两相间分配达平衡，K小的先出柱；多次分配平衡，K有微小差异组分仍可获较好分离。对于一根固定长度的色谱柱含塔板数n的多少，则作为柱效高低的一种量度。塔板理论亦称相平衡理论，由相平衡观点来研究分离过程。1、塔板理论四个基本假设2、色谱峰的二项式分布3、色谱峰的正态分布4、理论板数和理论塔板高度的计算一、塔板理论1、塔板理论四个基本假设1、塔板模型的基本假设塔板理论是建立在板模型基础之上的。设想一根色谱柱，由若干小段（H）组成。组分随流动相进入色谱柱后，在两相间进行分配。由于流动相移动，而固定相保持不动，虽然较快，组分不能在柱内各点瞬间达到分配平衡。但塔板理论假设：1）在柱内一小段高度H内，组分很快达到分配平衡。H为理论塔板高度（板高）

2）载气进入色谱柱中不是连续的前进，而是间歇式的，每次载气进入量为一个塔板体积。

3）所有组分开始时都加在柱中第零块塔板上，且样品沿色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略不计。

4）分配系数在各塔板上为常数。理论塔板的假设，实际上是把组分在相间的连续转移过程分解为间歇的在单个塔片中的分配平衡过程。即用分离过程的分解动作来说明色谱过程。1、塔板模型的基本假设塔板理论是建立在板模型基础之上的。设想（二）色谱峰的二项式分布（N<50）萃取法→利用物质在互不相溶两相中溶解度的不同（二）色谱峰的二项式分布（N<50）萃取法→利用物质在色谱分析法基本理论课件当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈不对称峰形。组分在柱出口的质量分数当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈3、色谱峰的正态分布（N

>

50）→近似对称分布讨论Cmax即流出曲线的峰高C：任意时间t时组分在柱出口处的浓度C0：峰面积，某组分的总量3、色谱峰的正态分布（N>50）→近似对称分布讨论Cm4、理论板数和理论塔板高度的计算理论塔板高度H：为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长。理论塔板数n：组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。4、理论板数和理论塔板高度的计算理论塔板高度H：为使组分在neff/n理=

(tR’/tR)2={tR’/[tM(1+k)]}2=[k/(1+k)]2

neff/n理=(tR’/tR)2={tR’/[t小结1）塔板理论的贡献：从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置阐明了保留值与K的关系提出了评价柱效高低的n和H的计算式2）在比较相似柱的柱效时有用须在给定条件，指定组分测定时才有意义小结1）塔板理论的贡献：从热力学角度2）在比较相似柱的柱效时例1：在柱长为2m的5%的阿皮松柱、柱温为100ºC，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定苯的保留时间为1.5min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和理论塔板高度。解：例1：在柱长为2m的5%的阿皮松柱、柱温为100ºC，记录纸5、塔板理论优缺点成功处：解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR

阐明了保留值与K的关系评价柱效（n、H）存在问题:1）做出了四个与实际不相符的假设，忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释影响板高的因素3）排除了一个重要参数——流动相的线速度u，因而无法解释柱效与流速之间的关系更无法提出降低板高的途径5、塔板理论优缺点成功处：存在问题:1956年荷兰学者VanDeemter等人在研究气液色谱时提出了速率理论，在塔板理论的基础上引入了影响板高的动力学因素，将色谱过程与柱内组分的分子运动联系起来，认为影响板高的因素有三，并建立了速率方程（范第姆特方程）。速率方程H=A+

B/u

+

Cu二、速率理论1956年荷兰学者VanDeemter等人在研究气液色速率理论阐明影响柱效（色谱峰扩展）的因素H=A+B/u+CuA：涡流扩散（eddydiffusion）系数也叫多径扩散系数B：纵向扩散（longitudinaldiffusion）系数C：传质阻抗（masstransferresistance）系数u：载气线速度速率理论

塔板高度—流速曲线由速率方程及上图可看到流速对柱效的影响：1）当u小时，B/u

项大，Cu

项小；2）当u大时，B/u项小，Cu项大；3）Hmin=A

+2(B.C)1/2

4）最佳载气速度：uopt

=

(B/C)1/2对于一根100cm长的柱来说，其最佳流量在5～50mL/min，或每小时0.3～3倍的柱体积。塔板高度—流速曲线由速率方程及上图可看到流速对柱效的影响：1、涡流扩散项（多径扩散项）：A产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力→不断改变流向，路径长短不一→涡流扩散影响因素：固体颗粒越小，填充越实，A项越小注：颗粒太小，柱压过高填充柱：60~100目空心毛细管柱（0.2~0.5mm），A=0，n理较高对于填充柱，填充均匀性与柱径大小有关，2—5mm最均匀讨论：1、涡流扩散项（多径扩散项）：A产生原因：载气携样品进柱，2、纵向扩散项（分子扩散项）：B/u产生原因：组分在固定相中被流动相推动向前、展开→前后存在浓度差r影响因素：讨论：2、纵向扩散项（分子扩散项）：B/u产生原因：组分在固定相注：为了减小纵向扩散，宜选用分子量较大的载气、较高线速度和较低柱温选择载气原则：兼顾分析时间和减小纵向扩散u

较小时，选M较大的N2气（粘度大）u

较大时，选M较小的H2气，He气（粘度小）注：为了减小纵向扩散，宜选用分子量较大的载气、较高线速度和较3、

传质阻抗项：C·u产生原因：样品在气液两相分配，样品未及分配平衡就被载气带走，有的则滞后，而造成峰扩张影响因素：固定液应完全覆盖载体表面，不可以太薄，否则柱子寿命短，k太小；T不可以超过固定液最佳使用温度采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度3、传质阻抗项：C·u产生原因：样品在气液两相分配，样品未小结：范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，以下各因素对柱效和峰宽的影响。（1）填充物填充均匀程度、粒度；（2）载气种类及流速；（3）色谱柱温度（4）固定相的液膜厚度（5）柱直径小结：范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，以下各因素对柱效1、流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）三、液相色谱中的速率理论

速率理论也适用于液相色谱。只是由于液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作流动相，使速率方程式中的纵向扩散项（分子扩散项）对H值的影响与气相色谱不同，可以忽略。1、流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）三、液相色谱2、涡流扩散项（多径扩散项）：A影响因素：dp：降低dp，采用小粒度固定相，常用3-5m。

：降低

，球形、粒度均匀的固定相。

使用小而均匀的填充颗粒能改善柱效讨论：2、涡流扩散项（多径扩散项）：A影响因素：讨论：3、传质阻抗项3、传质阻抗项色谱分析法基本理论课件H

=

A

+

Cu=A+Cmu+Csmu4、液相色谱中的速率理论

在液相色谱中，提高柱效的方法：1）减小填料孔穴深度；2）减小填料颗粒；3）用低黏度的溶剂作流动相；4）流动相采用低流速；5）适当提高柱温。H=A+Cu=A+Cmu+Csmu4四、色谱分离基本方程式（影响色谱分离的条件）n：理论塔板数

：选择因子（分配系数比）k2：色谱图上相邻两个组分中第二组分的容量因子柱容量项柱效项