益气活血中药对血管损伤活性物质调控机制的研究

益气活血中药对血管损伤活性物质调控机制的研究

内皮细胞是组织和血液之间的屏障。血管内皮细胞（pvc）损伤是心血管疾病的初始因素。采用结扎冠状动脉的方法建立大鼠急性心肌梗死(AMI)后心衰模型,通过观察血浆微血管内皮损伤敏感而特异的分子标志物可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)、可溶性血栓调节蛋白(sTM)的表达;血管收缩和舒张因子一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)、前列腺素2(PGI2)、血栓素A2(TXA2)的变化情况,揭示益气活血药改善冠脉微血管内皮损伤的调控机制。1材料表面1.1北京中小型动物研究所提供许可证健康雄性SD大鼠,体重(200±20)g,清洁级,8周龄,由北京中科院动物研究所提供,许可证编号:SCXK(京)2012-0001。1.2特效药1.2.1药物、药物和试剂呋塞米注射液,天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司,国药准字06051531;盐酸利多卡因注射液,国药集团容生制药有限公司,国药准字H20045250;注射用青霉素钠,石药集团中诺药业(石家庄)有限公司,国药准字H20023752;戊巴比妥钠,上海新亚药业有限公司,生产批号:H31021724;安尔碘,九州通医药有限公司,生产批号:20000009。1.2.2最佳剂量组合考察益气活血药由生黄芪、人参、当归、川芎、三七等组成。据前期益气活血药研究基础,从益气药、活血药比例1∶1、1∶2、2∶1选取疗效最佳剂量组合(2∶1)。依口服剂工艺制备,按处方比例称取中药材,加9倍量水,煎煮2次,每次2.5h,共5h,水煎液过滤,浓缩,加乙醇调含醇量至50%,过滤,回收乙醇,过滤,调整浓度为每毫升药液相当生药量2g。由北京中医药大学药厂提供。1.2.3培投资roe通心络胶囊,石家庄以岭药业股份有限公司,国药准字Z20100015,0.26g/粒;培哚普利,施维雅(天津)制药有限公司,批号:P2009971052951,规格:4mg/片。研究证实,培哚普利是长效的血管紧张素转换酶抑制剂,血管紧张素转换酶抑制剂长期治疗能促进病变的冠状小动脉结构修复。1.3试剂及材料ELISA试剂盒,北京尚柏生物医学技术公司。RSP1002型小动物呼吸机(KentScientificCorporation),备皮刀,气管插管套管(BD公司16号套管针改制),眼科弯镊3把,眼科直剪1把,蚊氏止血钳1把,巾钳1把,持针器2把,小动物开胸器1个,无菌带线缝合针(圆2/0、圆5/0),手术灯,洞巾,注射器(2mL)若干,棉棒、小棉球、胶布若干。2方法2.1肌肉注射激素采用左冠状动脉前降支结扎的方法。用1%戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)麻醉后,仰卧位固定,行气管插管,连接小动物呼吸机,在左侧第三、四肋间切开皮肤,钝性分离肌层,打开胸腔,充分暴露心脏,用带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间于左心耳下约2mm处,将左前降支连同少量的心肌组织一起结扎,然后迅速将心脏复位,关闭胸腔。全部手术过程在30min内完成,严格无菌操作。术后连续3d肌肉注射青霉素预防感染。以结扎部位以下心肌变灰白、搏动减弱,心电图肢体导联出现ST段弓背向上明显抬高为造模成功的标志。假手术组手术过程相同,仅绕过左冠状动脉,打松结。2.2灌胃药物治疗将造模成功的大鼠按随机数字表法分为:模型组、中药组、培哚普利组、通心络组,以假手术组作对照,共5组。各组于造模第1天开始分别灌胃相应药物,1次/d,剂量分别为通心络0.23g/kg、培哚普利0.4mg/kg(临床等效剂量)、益气活血药21g/kg(前期研究确立)。各干预药物均溶于无菌蒸馏水中,在保证药物剂量的前提下,调整浓度使每只动物给药容积均为10mL/(kg·d),假手术组和模型组不进行药物干预,每日以相同容积无菌蒸馏水灌胃。2.3观察指标和方程式2.3.1he的光学观察将心肌组织用不同浓度酒精梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡、包埋、切片,脱腊,二甲苯透明,HE常规染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封固,光学显微镜观察。2.3.2试剂盒上的指标观察用ELISA试剂盒检测血液中NO、ET-1、PGI2、TXA2和EPCR、TM水平,具体操作按照试剂盒上说明操作,分别观察7、28d指标的变化情况。2.3.3pcr扩增体系测定血栓调节蛋白(TM)、内皮细胞蛋白受体(EPCR)的mRNA表达。(1)提取总RNA及反转录。每组取6个心肌标本,每个约100mg,Trizol试剂盒提取总RNA,取2μg总RNA逆转录合成cDNA,-20℃保存,GAPDH作内标基因,同时扩增,比较各组TM、EPCR的mRNA表达强度差异。TM上游引物序列:5′-GGGGGTGACTAGATGGGACT-3′,下游:5′-CCCAAGGGAGGTCCCAATTC-3′,扩增片断长度为110bp。EPCR上游引物序列:5′-CCCTCCGAAGCCATCAACTT-3′,下游:5′-TGTTTGGCTCCCTTTGGTGT-3′,扩增片断长度144bp。GAPDH上游:5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游:5′-CTCGCT-CCTGGAAGATGGTG-3′,扩增片断长度为233bp。(2)荧光PCR反应体系。SYBRGreen1染料25μL,上游引物1μL,下游引物1μL,Taq聚合酶2μL,待测样品cDNA2μL,ddH2O20.7μL,共计50μL。(3)荧光PCR反应程序。荧光95℃2min预孵育,然后按95℃20s、59℃25s、72℃30s,进行扩增,共做45个循环,最后从65℃到95℃温度缓慢升高过程中溶解20s。最后对数据用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。2.4统计学处理所得数据均用均数±标准差表示,全部数据采用Excel和SPSS统计分析软件进行数据处理。单变量计量资料样本均数间比较,若符合正态分布,用单因素方差分析(One-WayANOVA);多重比较用LSD或者SNK法,若方差不齐,则用Games-Howell分析;双侧检验,检验水准为P<0.05。计数资料采用χ2检验。个别不符合正态分布数据则采用非参数检验,具体采用SPSS统计软件。3结果3.1手术和ami造模成功后临床资料及死亡情况采用冠状动脉结扎法致大鼠急性心肌梗死后,肢导Ⅱ导联心电图ST段呈弓背向上抬高,缺血心肌很快变苍白色。共手术100只,随机分成7d观察组和28d观察组。其中7d观察组中,手术中死亡3只,AMI造模成功24h内死亡2只,给予药物治疗后死亡2只,注射麻药行心脏超声检查后死亡1只;28d观察组中,手术中死亡5只,AMI造模成功24h内死亡1只,给予药物治疗后死亡1只,注射麻药行心脏超声检查后死亡4只。总计造模成功81只,其中7d观察组大鼠42只,28d观察组大鼠39只。3.2各组大鼠心肌形态的观察3.2.1病理组织学检测假手术组:大鼠心外膜未见纤维素渗出及炎细胞浸润。模型组:心肌梗死区炎症反应明显,有泡沫状组织细胞聚集,大量中性粒细胞浸润,心肌纤维断裂、排列紊乱,坏死的心肌组织由新生的肉芽组织取代;梗死区边缘有充血、出血及炎细胞带,心外膜有炎性及纤维素性渗出物。培哚普利组:病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小。通心络组:病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,较培哚普利组病变范围较小。益气活血组:病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,较培哚普利组及通心络组病变范围较小。结果见图1(彩图见插页2)。3.2.2病理改变试验假手术组:大鼠心外膜未见纤维素渗出及炎细胞浸润。模型组:心肌梗死区由纤维母细胞和纤维细胞以及致密的胶原纤维束组成,呈束状或平行排列,胶原纤维束之间有极少残存的心肌组织,炎性细胞浸润明显减少,地图状瘢痕组织形成;心室腔扩大,室壁变薄;培哚普利组:病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,且梗死区有岛状或细带状的心肌组织。结果见图2(彩图见插页2)。通心络组:病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,且梗死区有岛状或细带状的心肌组织,但较培哚普利组病变范围较大。益气活血组:病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,且梗死区有岛状或细带状的心肌组织,但较培哚普利组病变范围较大。3.3药物作用对培投资的影响与假手术组比较,模型组大鼠血清ET-1、TXA2含量明显升高,NO、PGI2水平下降,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,益气活血组、培哚普利组及通心络组ET-1、TXA2含量下降,NO、PGI2水平明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。随着用药时间的增加,药物作用增强,培哚普利的作用好于益气活血组和通心络组,后两者之间无明显差异。结果见表1、表2。3.4各组小鼠血清中5d临床资料的比较与假手术组比较,模型组大鼠血清sEPCR、sTM含量明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,益气活血组、培哚普利组及通心络组sEPCR、sTM含量下降,有非常显著性差异(P<0.01)。其中,7d时间点,益气活血组作用好于通心络组和培哚普利组;28d时间点,培哚普利的作用好于益气活血组和通心络组,后两者之间无明显差异。结果见表3、表4。3.5两组epcr和tm的mrna含量对比与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中EPCR、TM的mRNA含量明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,益气活血组、培哚普利组及通心络组EPCR、TM的mRNA含量下降,有非常显著性差异(P<0.01)。其中培哚普利的作用好于益气活血组和通心络组,后两者之间无明显差异。结果见表5、表6。4刑事司法干预对血管内皮功能的影响血管内皮功能变化对于血管病变来说具有举足轻重的作用,心梗后心肌缺血诱发的血管内皮损伤促使各种细胞因子的释放,引发了微循环障碍和心肌细胞的增殖,在心梗的发生发展中起着重要作用。实验结果显示益气活血中药干预后,可减少血清ET-1、TXA2含量,增加血清NO、PGI2含量,改善血管痉挛状态,增加心肌供血,修复受损内皮细胞功能,逆转缺血、缺氧造成的细胞形态、功能、代谢的改变,增加局部心肌组织的血流灌注量,提高心肌细胞的供血,调节微循环的血流灌注,从而有效地改善心肌微循环。此外,益气活血中药可以明显降低sTM、sEPCR水平,并降低心肌组织中TM、EPCR的mRNA表达,推测益气活血中药可以降低膜结合型EPCR、TM的损伤,使sEPCR、sTM水平下降,由于EPCR、TM的降解减少,抑制EPCR、TM的mRNA代偿性增加,因此益气活血中药具有保护内皮细胞的作用。血管舒张因子NO和血管收缩因子ET-1起着重要的调节作用,NO分泌减少,ET-1增多,导致持续的血管收缩而加重心肌缺血和损伤。TXA2和PGI2是一组由血管内皮细胞合成并分泌的血管活性物质,对冠状血管的收缩和舒张有着重要的调节作用。sEPCR、sTM等可作为微血管内皮损伤敏感而特异的分子标志物,对维持微血管内环境稳定具有重要作用,这些因素失常对调节冠脉微血管功能和组织供血有重要影响。因此,监测这些指标水平的变化能比较全面而直观的反映血管内皮细胞功能。急性心肌梗死患者大部分存在“气虚血瘀”的病因病机,中药可以保护缺血心肌再灌注损伤和血管内皮组织。人参具有保护心肌缺血再灌注损伤(MIRI)、抗心律失常、改善血流动力学、调节血脂代谢、提高耐缺氧能力、抗休克以及保护心肌等作用。黄芪中的黄芪多糖能够减轻慢性心肌缺血时的心肌氧化损伤,其可能通过调节氧化及抗氧化因子的表达发挥作用。当归对缺血心脏冠脉血管有明显的扩张作用,促进建立心肌侧支循环,改善心肌血流分布,减轻因缺血再灌注引起的细胞结构的改变。川芎有增强心肌收缩力、扩张脑外周血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抗肿瘤、镇静和抑菌等作用。三七具有活血化瘀作用,能够增加冠脉血流量,减慢心率,降低心肌耗氧