大鼠侧脑室内注射致大鼠脑组织损害的多因素分析

大鼠侧脑室内注射致大鼠脑组织损害的多因素分析

随着对重性胰腺（cp）发病机制的深入研究和疗效的提高，胰腺性脑病已成为临床癫痫研究的重点之一。虽然胰性脑病的概念早在1941年已由Rothermich等提出,然而半个多世纪来对胰性脑病的认识仍没有明显进展。我们通过回顾性分析发现胰酶并非是导致胰性脑病的惟一原因,在胰腺炎病程中存在多种可能导致神经精神障碍的原因,如真菌和细菌感染、水和电解质紊乱引发的高渗透压环境等。肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性介质被认为在SAP发生、发展过程和多脏器功能障碍中起着重要作用。Farkas等报道SAP时TNF-α使血脑屏障的通透性增加,提示其与胰性脑病的发生有关。目前,对胰性脑病其他可能病因的认识尚无相关报道。本研究通过对大鼠侧脑室分别注射细胞因子、高渗NaCl溶液、细菌和真菌悬液,旨在这些病理因素条件下观察大鼠脑组织的形态学改变,探讨其与胰酶引发的脑损伤是否存在差别。材料和方法一、细菌分离和活性清洁级雄性SD大鼠48只(中科院上海实验动物中心提供),体重(218.0±33.6)g,随机分为6组:胰脂肪酶组、TNF-α组、高渗组、真菌组、细菌组和对照组,每组8只大鼠。分别对各只大鼠侧脑室注射实验试剂,剂量为10μl/100g体重。胰脂肪酶组大鼠予50U/ml精制胰脂肪酶(Sigma公司)溶液;TNF-α组大鼠予1000pg/mlTNF-α(Sigma公司)溶液;高渗组予10%NaCl;真菌组予0.5麦氏浓度白色念珠菌悬液;细菌组予0.5麦氏浓度大肠埃希菌悬液;对照组予0.9%NaCl(NS)。实验用白色念珠菌、大肠埃希菌为本院细菌室制备,分别从已孵育18～24h琼脂平板上挑出单个菌落,用NS配置浊度为0.5麦氏浓度的菌悬液。实验前大鼠禁食不禁饮12h,2.5%戊巴比妥钠0.1ml/100g腹腔内注射麻醉。立体定位仪固定大鼠头部,以前囟为标志,自该点向后1.0mm、旁开1.5mm处作为侧脑室穿刺点,颅骨钻孔,直径为2.0mm;将外径0.5mm的微量注射器垂直插入侧脑室,深4.0mm。所用试剂经手控缓慢恒速注入侧脑室,注入速度为20μl/min。胰脂肪酶组、TNF-α组、高渗组和对照组大鼠在注射实验试剂3d后采集脑组织标本,真菌组和细菌组大鼠在7d后采集脑组织标本。二、超微病理学检查大鼠新鲜大脑标本于视神经交叉处作冠状位切片取材。每组中取6只大鼠于光镜下检查:标本经10%甲醛固定后石蜡包埋,常规组织切片,苏木精-伊红染色后光镜观察。余2只作透射电镜检查:再次戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉,迅速开胸经左心室至主动脉插管,先以100mlNS洗去血液,随后用4℃含40g/L多聚甲醛的0.1ml/L磷酸缓冲液(pH7.4)先快后慢灌流固定脑组织2h,取大脑组织1mm3数块作超微病理学检查,2.0%戊二醛固定和1.0%锇酸PBS后固定(4℃,各2h),梯度乙醇脱水,环氧丙烷置换两次,618液包埋浸透,LKBV型切片仪超薄切片,枸橼酸铅染色,HitachiH-500型透射电镜观察。三、组织学评分采用盲法行光镜和透射电镜观察,对神经元、胶质细胞、髓鞘和血管分别作组织学评分,评价方案见表1。合计各组评分得出严重度分级:<6分为轻度;6～9分为中度;9～12分为重度。四、统计分析用SAS软件包(6.12)对组织学评分值行Wilcoxon秩和检验。结果一、肢体运动障碍各处理组大鼠多数表现活动减少、反应迟钝、进食减少、昏睡;部分大鼠的单侧前后肢体运动功能障碍,行走蹒跚;少数表现易激惹。对照组无明显异常行为改变。二、病理组织学检测1.TNF-α组:脑组织在光镜下可见散在神经元和星形胶质细胞水肿,部分毛细血管扩张和水肿(图1A);电镜下见部分神经元细胞器水肿,如线粒体和内质网,髓鞘板层结构呈局灶性或散在紊乱。2.胰脂肪酶组及高渗组:上述病变加重,光镜下可见广泛神经元和星形胶质细胞水肿,毛细血管水肿明显,少量胶质细胞增生;电镜下见到胞核形态不规则、染色质边集,广泛髓鞘板层结构紊乱(图1B),毛细血管内皮细胞破坏。3.真菌组及细菌组:上述病变严重,表现为光镜下增生小胶质细胞聚集成团(图1C),呈嗜神经元现象,部分可见脑实质内点、片状出血(图1D)及脑脓肿;电镜下见神经元核固缩、核碎裂,有时见到神经元凋亡,神经纤维网结构破坏,髓鞘板层结构崩解,轴突髓鞘脱失。4.对照组:未发现明显脑组织病变。各组脑组织学评分及严重度评估见表2。讨论一、中小型患者胰酶感染的发病机制动物实验和临床前瞻性研究已证实胰酶与胰性脑病的关系。Estrada等报道胰性脑病病人脑脊液中脂肪酶异常升高,Vogel将脂肪酶注射入实验家兔侧脑室复制出与临床尸检相类似的病理学改变。但是,胰酶不足以解释临床上所有的胰性脑病。已证实急性坏死性胰腺炎大鼠早期存在髓鞘结构的损伤,这可能与SAP早期炎性介质的过度释放和水、电解质紊乱引发的高渗透压环境有关;SAP中、后期真菌和细菌感染也是其可能原因。肠道起源的革兰阴性菌是SAP的常见感染菌种,特别是大肠埃希菌所占比例呈逐年上升趋势。疾病消耗、大量应用广谱抗生素、肠道功能障碍、肝功能受损和深静脉营养等均使病人容易感染以白色念珠菌为主要类型的真菌。二、实验大鼠血浆胰脂肪酶和tnf-浓度对大鼠脑梗死超早期感染的影响我们采用Vogel的研究方法,分别将TNF-α、10%NaCl、真菌悬液及细菌悬液注入大鼠侧脑室,并设立胰脂肪酶组为阳性对照,NS组为阴性对照,观察脑组织形态学改变。研究将胰脂肪酶组和TNF-α组所用的溶液根据Norman等测定的坏死性胰腺炎大鼠血浆胰脂肪酶和TNF-α浓度配制。结果显示在此浓度条件下二者均导致不同程度的神经元水肿、髓鞘脱失和小胶质细胞增生。高渗组所用的NaCl浓度是临床输液较常用的。白色念珠菌和大肠埃希菌是SAP病人真菌和细菌感染常见的菌种。Vogel在2～3d就观察到实验家兔脑组织脱髓鞘等改变,因此我们对胰脂肪酶组、TNF-α组、高渗组大鼠于造模3d后取脑组织检测。细菌组和真菌组大鼠的存活期较长,约2～3周,但在7d左右已表现出明显的行为学改变,故在造模7d后取脑组织检测。实验结果表明,这些取材时间可反映脑损伤的改变,然而由于取材时间的不同,结果之间的比较需慎重,例如感染导致的脑组织损伤最重,但是如果其他各组大鼠在7d观察脑组织,尚不能排除达到相同甚至更严重的病变。三、脑室途径的致重性在前期研究中,我们通过大鼠颈内动脉分别注入细胞因子、高渗液、细菌和真菌悬液,证实上述因素对脑组织不同程度的损伤作用。本实验为去除血脑屏障的影响,直接将损伤因子注入侧脑室。结果发现同一因素在经侧脑室途径时并未表现出比颈内动脉途径时更为严重的损伤,这可能与经侧脑室途径时所用的剂量较小有关;但不同因素的所致轻重程度的变化趋势在两种途径下是一致的。细胞因子、细菌和真菌感染以及高渗透压环境都会造成与胰酶相类似的脑组织损伤。不同病理因素所导致的脑组织损伤严重程度有差异,细菌