细胞学自主实验 染色体核型分析

人体外周血淋巴细胞培养、染色体制备及染色体核型分析09级一班3组摘要：细胞培养是指在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。处于增殖期的培养淋巴细胞经过秋水仙素处理，可停留在分裂中期或早中期，这一时期的染色体形态为棒状结构，是观察分析染色体的最佳时期实验目的1．学习人体细胞离体培养的方法；2．掌握制作人染色体标本的方法；3．观察人类染色体的形态和染色体数目；4．熟悉染色体核型分析。二、实验原理细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新获得有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认与观察。染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。各种生物染色体的数目、形态和结构都是恒定的。染色体核型或组型，指一个个体或物种的特有的染色体构成，包括染色体数目以及每一条染色体所特有的形态特征（染色体的长度、着丝粒的位置、臂比值、随体的有无、次级缢痕（缢痕：中期染色体染色很浅且呈狭细的部位，此处染色质呈非螺旋化。）的数目及位置、异染色质的分布等）。核型是物种最稳定的性状和标志，通常在体细胞有丝分裂中期时进行核型的分析鉴定，也可利用减数分裂期的染色体进行分析鉴定。染色体核型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。绝对长度（μm）=放大的染色体长度÷放大倍数绝对长度＝照片长度/放大倍数相对长度（%）=每个染色体长度÷染色体组总长度×100%臂比=长臂长度÷短臂长度着丝粒指数=短臂÷该染色体长度×100%三、实验材料、器材、试剂1、材料人的静脉外周血器材细胞培养培养瓶2个橡皮塞2个移液抢200uL一个、1000uL离心管2个滴管2个封条1个染色体的制备滴管5个离心管6个染缸1个载玻片8个量筒50mL、10mL（四个组共用10mL、100mL、1000mL）试剂（1）、完全RPMI-l640培养液，含双抗（抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素：50000U/ml，均用无菌生理盐水配制。培养液中的终浓度均为100U/ml）和小牛血清（2）、秋水仙素溶液0.1mg/mL。（3）、PHA体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。10mg/mL、200uL适应范围100ug/L-200ug/L（4）、Carnoy固定液（体积比甲醇∶冰乙酸=3∶1）30mL甲醇和冰乙酸10mL混合(5)、1/15mol/L磷酸缓冲液pH6.81ml1mol/L标液+14ml蒸馏水（看清化学式

NaH2PO4·）(6)、Giemsa染液Giemsa染液Giemsa原液配制：称Giemsa粉末0.8g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为50（7）、低渗液：0.075mol/LKCl溶液(实验室应该会提供吧)否则用标液1mol/L（标液）的KCl配置7.5ml标液+92.5ml蒸馏水（8）、5%NaHCO3用于调节培养基PH值（已经调好）四、操作方法（一）药品器皿的无菌处理1．实验用的所有器皿，器具都必须按规定洗净，高压灭菌处理备用。（二）实验步骤1培养液配制（在超静工作台内无菌操作）培养液（已加入血清）5mL，加入PHA浓度为10mg/mL100uL（加入双抗至最终浓度100ug/mL？）混匀（PH已调好）。2、采血取灭菌的2ml针筒，用肝素湿润（医院加入）。用碘酒和酒精消毒皮肤，抽取静脉血1ml。3、接种常规消毒后，立即将灭菌小瓶，送入超净工作台，在火焰旁将男女血液分别滴入2个盛有5ml培养液的培养瓶内，共2个培养瓶，每瓶0。5ml，盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，分别为男、女。培养置37℃温箱内培养66—72小时—这个时间恰好是白细胞分裂的两个周期（每天摇4次）秋水仙素处理在终止培养前4个小时加入秋水仙素，取0.1mg/mL秋水仙素液30uL加入培养瓶，在温箱（37度）继续培养。6、离心从培养箱中取出培养瓶，用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入离心管内，同时贴好与烧瓶对应的标签，相对离心管平衡后放入离心机，离心10min（1000转/分），吸去上清液，留下沉淀物。7、低渗处理先加入1mLmol/LKcl溶液,轻轻吹打,使细胞悬浮,然后补加6mLKcl溶液，放回37℃恒温培养箱中，静置208、固定1向离心管中加入固定液2ml，轻轻吹打均匀，在室温下放置5分钟。9、离心2男、女离心管，1000转/分离心10min，吸去上清液，留下沉淀物。10、固定2沿离心管壁加入新配固定液6ml，吹打均匀，室温放置20分钟，1000转/分离心10分钟，吸去上清液，留下沉淀物。11、固定3同上12、制片上述离心管中滴入固定液0.5毫升,用滴管小心冲打成悬液,从冰箱的冰格中或低温冰箱中取出载玻片,每片滴加悬液1—3滴，用嘴轻轻吹散，用电吹风吹干，或在酒精灯火焰上微微烤干13、染色Geimsa染色液染色30分钟，然后倒去多余染液。并用蒸馏水轻轻冲洗。镜检待稍干后，在显微镜下检查。先用低倍寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。15、实验结果处理人的染色体2n=46,其中22对常染色体,一对性染色体.男性是XY,女性是XX.按照染色体个体大小和着丝点位置,人们将46条染色体分为A,B,C,D,E,F和G等7个组。16、染色体组核型分析（1）剪贴：将染色体数目为四十六条，染色体的形态、分散度均较好的照片，PS处理（便于观察和测量），并将染色体抠出制成图片。（2）配对：首先目测配对，根据染色体长短和形态特征，进行同源染色体配对，分组。（3）排列：按一定顺序将一个细胞内的染色体进行排队、编号，并写明A-G组号，染色体从大到小编为1-22号，性染色体单独列为一组。排列方式有多种，一般从大到小排列；相同长度的染色体，按短臂长度排列，短臂长的在前；有特殊标记的染色体（如随体）可特殊排列；性染色体单独另排或放在最后。也可将形态相同的染色体归为一组，分成若干组，按组排列。（4）测量：利用测量工具，测量染色体的如下数据：1）

绝对长度＝照片长度/放大倍数2）

每对染色体短臂绝对长度；3）

每对染色体长臂绝对长度；4）

染色体短臂总长度；5）

染色体长臂总长度；6）

相对长度：相对长度（%）=每个染色体长度÷染色体组总长度×100%7）

臂比：臂比＝染色体长臂／染色体短臂8）臂指数：着丝点指数＝短臂÷该染色体长度×100%五、注意事项1.PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。浓度一般用1％～2％，每毫升培养液加0.2～0.4ml；浓度过高可能会导致红细胞凝集。2.培养箱的温度应控制在37±0.5℃3.培养基的pH值应该在7.2-7.4左右，低了细胞生长不良，高了细胞则会出现轻度的固缩。4.在采血接种培养是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂。但肝素量也不应太少，以免发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结构。这种膜状物一般在培养24小时左右出现，此时可在无菌条件下将它除去以免影响培养效果。5.无菌操作的要领和要求1）培养前准备

为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。2）超净工作台消毒

打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。3）洗手

操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2%新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。4）火焰消毒

在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。烧过的用具都要待冷却后再接触细胞，否则会烧焦形成炭膜，再用时会把有害物质带入培养液中。5）操作

进行培养操作时动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动增加污染机会。不能用手触及器皿的消毒部分。如已接触，要用火焰烧灼消毒或更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理布局。原则上是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧；酒精灯置于中央。培养液等不要过早开瓶，打开的培养液和培养用瓶等应保持斜位或平放，长时间开口直立，易增加落菌机会。吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。6.在普通培养箱内培养时，必须将培养瓶口盖紧，以免培养液的PH发生较大的变化。如果培养过程中，培养液酸化比较严重（培养液呈黄色时）将不利于细胞生长，此时可加入适量无菌的0.14%碳酸氢钠溶液调整或再加入2～3ml培养液来校正。培养箱的温度应控制在37℃+0.57.染色体标本质量不佳的原因。如果淋巴细胞转化试验表明培养物生长发育良好，但制成的标本质量不佳时，其原因可能为：=1\*GB2⑴秋水仙素处理不当：一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。=2\*GB2⑵低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。=3\*GB2⑶离心速度不合适：如果从培养瓶收集细胞后进行离心时的速度太低，细胞可能被丢失；如果细胞被低渗后离心速度过高，往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相丢失，以致制出的标本分裂相较少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。=4\*GB2⑷标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞