地中海贫血的诊断与分型

地中海贫血的诊断与分型

地中海贫血（算盘白生成的恶性贫血）是由地中海沿岸的民族继承下来的。由于所继承的蛋白基因的缺陷，患者的红细胞中存在多个蛋白环，如缺乏或缺失的红细胞，导致无效红细胞的生成和溶血。病理状态也被称为“珠江白生成障碍贫血”。由于基因缺陷的复杂多样(异质性),导致缺乏的珠蛋白链的类型和数量不同,因此患者的临床表现也不尽相同,轻者可能终生无症状,重者胎儿期就可死于宫内。因此,自1925年由Cooley和Lee首先描述该疾病开始,对于这一人类常见基因缺陷病的研究一直未终止,尤其是随着基因诊断技术的不断提高,在胚胎早期诊断地中海贫血已成为可能。珠蛋白链缺乏的类型按照血红蛋白(hemoglobin,Hb)的4级结构,每个Hb分子由2对珠蛋白肽链构成的球形4聚体,一对是α链(α链和ξ链),另一对是β链(ε、β、γ、δ链)。这6种不同的珠蛋白链组成了人类不同的6种Hb,分别是HbGowerⅠ、HbGowerⅡ、HbPortland、HbF、HbA、HbA2,随发育的不同阶段先后出现,到成人主要是后3种,HbA占95%,HbA2占2.0%~3.5%,HbF小于1.5%。无论是国际上还是我国,目前仍根据珠蛋白链缺乏的类型进行地中海贫血命名和分型。α珠蛋白链缺乏者为α地中海贫血(α珠蛋白生成障碍性贫血),β珠蛋白链缺乏者为β地中海贫血(β珠蛋白生成障碍性贫血),其他少见的还有γ地中海贫血、δβ地中海贫血(δβ0、δβ+、血红蛋白Lepore综合征δβ融合基因)和遗传性胎儿血红蛋白持续存在征(HPFH,多见于黑人,分为缺失型和非缺失型,HbF升高,红细胞内HbF呈均匀分布,无明显贫血表现)等。α地中海贫血和β地中海贫血又可根据所缺乏的珠蛋白基因的种类、程度及临床表现再分型。α地中海贫血基因位于16号染色体短臂13区3带(16p13.3),α珠蛋白链完全不能合成者称为α0珠蛋白生成障碍性贫血,尚能合成少量者称α+珠蛋白生成障碍性贫血;根据α基因缺失数目(决定临床表现的有无和轻重)分为4种类型,即静止型(1个α基因异常)、标准型(2个α基因异常)、HbH病(3个α基因异常)和重型(4个α基因异常,HbBart′胎儿水肿综合征)。β地中海贫血基因位于11号染色体短臂1区2带(11p1.2),β珠蛋白链完全不能合成者称为β0珠蛋白生成障碍性贫血,尚能合成少量者称β+珠蛋白生成障碍性贫血;根据临床表现可分为轻型(杂合子)、中间型和重型(纯合子)。制备绿地血型根据典型的临床表现和实验室检查特点,结合患者的家族史及流行病学,诊断地中海贫血一般并不困难。重点是其中少见类型的发现和基因类型的精确诊断。一、病害是最严重的区域本病以地中海沿岸和东南亚各国较多见,我国则以华南地区发病率高,尤其是广东、广西、海南等地区,湖南、贵州、云南、四川等也是高发区,而北方很少见。二、临床表现与家庭1.hbarhbrthbbachis分型(1)静止型:静止型α地中海贫血患者可无任何临床症状和体征,其父母一方有α地中海贫血。(2)标准型:标准型亦称α地中海贫血特征、轻型α地中海贫血。该型患者的临床症状轻,存在轻度贫血;其父母一方有α地中海贫血。(3)HbH病:HbH病亦称中间型α地中海贫血。该型患者的临床表现多样,年幼时多无症状,约半数患者在20岁以后发病。多数患者病情较轻,主要表现为轻、中度的贫血和长期慢性溶血导致的肝脾肿大;重者则伴有黄疸;少数可伴骨骼轻微改变,不影响生长发育,因此无地中海贫血外貌。妊娠、感染、服用磺胺类或氧化剂药物时可诱发其溶血加重,某些严重者的表现与纯合子型β地中海贫血类似。往往患者的父母双方都有α地中海贫血。(4)HbBart′s胎儿水肿综合征:一般患有HbBart′s胎儿水肿综合征的胎儿在妊娠30~40周时即可发生宫内死亡,或在早产或出生后数小时内死亡。患病胎儿皮肤苍白、全身水肿和各浆膜腔积液,伴或不伴有黄疸、皮肤出血、肝脾肿大,胎盘大而脆,脐带水肿明显。其父母均为--/αα型地中海贫血。2.海投血性血症(1)轻型:轻型β地中海贫血患者大多数无临床表现,少数可有轻度贫血和脾肿大;其父母一方为β地中海贫血杂合子。(2)中间型:中间型β地中海贫血患者可存在中度贫血和脾肿大;少数有骨骼改变(轻度),性发育延迟。(3)重型(Cooley贫血):重型β地中海贫血患者出生时正常,而在6~12个月后其贫血进行性加重,伴有黄疸和肝脾大;生长发育迟缓,精神萎靡,智力迟钝,性征不全,易感染;骨皮质变薄,骨骼变脆,甚至发生病理性骨折。其中大部分具有典型的地中海贫血特殊面容,表现为额部隆起、鼻梁凹陷、眼距增宽。患者的父母双方均为β地中海贫血杂合子。三、网织红细胞的形态1.血常规:红细胞呈典型的小细胞低色素性(平均红细胞容积、平均红细胞Hb含量降低)改变是地中海贫血的特征,可有或无Hb水平的降低。许多地中海贫血患者均在体检血常规检查中被发现和诊断。不同类型地中海贫血患者的红细胞体积略有差异,往往随着其临床表现的加重,平均红细胞容积、平均红细胞Hb含量降低程度也更明显,重型β地中海贫血的平均红细胞容积常50~70fl/细胞,网织红细胞增高可达60%以上。2.血细胞形态:地中海贫血患者的血细胞形态无特异性,表现为继发溶血的血细胞形态改变,如靶形红细胞、“马铃薯片形”细胞。HbH病患者的血涂片经煌焦油蓝染色后,可见红细胞中含有灰蓝色、均匀、圆形的颗粒状HbH包涵体。其骨髓象主要表现为红系增生活跃,重者的铁染色可示含铁血黄素显著增多。3.生物化学检测:根据患者溶血的情况,其血清间接胆红素和血清铁蛋白均有不同程度的升高,后者也是鉴别缺铁性贫血的主要指标。四、血红蛋白电泳分析1.红细胞渗透脆性实验:地中海贫血患者的红细胞渗透脆性降低。由于其红细胞膜存在形态、生化、代谢异常,在低渗盐溶液中易膨胀破裂而溶血。该试验是地中海贫血群体筛查最简便的方法。2.抗碱血红蛋白测定:抗碱血红蛋白测定检测的是抗碱Hb,为HbF的筛查试验。然而除HbF外,HbBarts和部分HbH也具有抗碱能力,需通过血红蛋白电泳分析来鉴别。3.Hb电泳:Hb电泳简单易行,是临床诊断地中海贫血最常用的方法。不同的Hb等电点不同,在一定pH缓冲液中带有不同的电荷。当缓冲液的pH大于该Hb的等电点时,其带负电荷,电泳时向阳极游动;反之,Hb带正电荷向阴极游动。经一定电压和时间的电泳后,电荷不同、相对分子量不同的Hb,泳动方向和速度不同,从而分离出各自的区带。正常成人Hb在pH为8.6的条件下,电泳显示3个条带,即HbA(α2/β2,占97%)、HbA2(α2/δ2,占2%~3%)和HbF(α2/γ2,占1%);而发生β珠蛋白生成障碍时,往往HbA2>3.5%、HbF>5%。关于地中海贫血的不同Hb定量值总结见表1、2。hb电泳的一般检测方法一、hb/hba机电泳醋酸纤维薄膜电泳是临床常用的筛查地中海贫血的方法。醋酸纤维薄膜是均匀的微孔物质,其对蛋白质的吸附极少,因此该方法的优点是拖尾现象少、图像清晰、分离速度快、样品用量少且易于洗脱定量。行醋酸纤维薄膜电泳时常规采用pH8.6的TEB缓冲液,而采用pH6.5的TEB缓冲液进行Hb电泳时易分离HbH与HbBarts。但醋酸纤维薄膜电泳影响因素较多,如电压、电泳时间、醋酸纤膜质量、染料浓度等;且由于HbF与HbA等电点接近,很难分辨出HbA稍后的HbF区带,因此醋酸纤维素膜电泳对HbF分辨率有一定的局限性,从而影响了结果的可靠性。二、土地应采用0/0土地聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率高,可检出醋酸纤维素膜电泳中与HbA不易区分的不稳定Hb、潜在的异常Hb和绝大多数α地中海贫血,明确区分β0地中海贫血与β+地中海贫血。本方法简单易行,对地中海贫血(珠蛋白生成障碍性贫血)的诊断有重要参考价值。然而,琼脂糖凝胶电泳不能区分HbE与HbA2。三、客观标准诊断法毛细管电泳综合了电泳和色谱两者技术的优点。与上述传统的薄膜或凝胶电泳相比,不仅无需染色,且速度快、所需样本量少。我院实验室采用该技术可以在30min内一次性将5种珠蛋白肽链完全、准确地分离,得出HbA、HbA2、HbF、HbH、HbBarts各组分的百分比。该方法操作简便,重复性好,省时高效,适用于血红蛋白病的快速诊断,也是目前我国地中海贫血筛查常用的方法。尽管血红蛋白电泳在技术上不断改进和完善,但目前仍不能将HbE、HbA2两者区分开,因此无法完全鉴别出部分静止型地中海贫血,有一定的漏诊率,需进行基因分析等来诊断这部分人群。hba的分离和测定国际地中海贫血协会广泛推荐使用HPLC作为Hb分析参比方法。其原理是利用离子交换树脂作为固定相,根据各Hb的理化性质不同,其在分离柱中停留的时间也不同,从而将各Hb分离。HPLC可分离和定量HbF和HbA2,有助于β地中海贫血、δβ地中海贫血、遗传性胎儿Hb持续存在征的诊断。而且HPLC不受标本质量如高脂、黄疸等血标本的干扰,检测准确率高,重复性好,对地中海贫血尤其是β地中海贫血的诊断具有很好的临床价值,而其不足之处是对α地中海贫血筛查仍有一定局限性,需进行基因检测以提高诊断的准确率。利用电喷雾质谱和基质辅助激光解吸放电时间质谱质谱分析法是近代发展起来的快速、微量、精确测定相对分子质量的方法,在此基础上设计的电喷雾电离质谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,可提高异常Hb的检出,作为Hb电泳和HPLC方法的补充。但该方法对大分子物质的解析度有限,在检测前需用胰蛋白酶预处理成较小的蛋白分子方能进行,因此临床上仍有部分变异的Hb不能被发现。处理工艺在土地活检中的应用基因检测是地中海贫血的确诊实验,具有更直接、特异、灵敏的特点,可明确基因型及基因缺陷部位,但实际中不可能对每一个患者都进行全部基因序列的检测。由于大多数的α地中海贫血均由基因缺失所致,而90%以上的β地中海贫血是由基因突变所致,所以在基因分析时,对于α地中海贫血,先检测常见的大片段缺失,然后再检测少见的点突变;对于β地中海贫血,先检测常见的17种突变,然后再检测少见的大片段缺失。常用的基因检测方法有基因探针、DNA微阵列、限制性内切酶图谱分析、聚合酶链反应(PCR)、扩增不应突变系统技术、多重突变引物延伸技术、反向斑点杂交、特异性寡核苷酸杂交等一系列分子生物学技术。Gap-PCR可用于α地中海贫血基因携带者的一线筛查。基于Gap-PCR原理设计,建立检测常见缺失型α地中海贫血突变(-SEA、-A3.7和-A4.2)的单管多重PCR技术,可成功检出这3种常见缺失型α地中海贫血突变的纯合子、杂合子和双重杂合子,具有简单、快速、准确、可靠、经济、实用的优点,目前也常可用于地中海贫血的产前诊断。与常规血液学筛查方法比较,Gap-PCR分子筛查技术更具有特异性和可靠性。二、高灵敏性原则反向斑点杂交法是目前国内对β地中海贫血诊断率最高的方法,其具有快速、简便、高灵敏度和特异性强的特点。但在反向斑点杂交检测过程中,斑点信号可能会存在不均一现象,且该检测受到各种试验因素、条件的影响,其稳定性和重复性有待提高。三、系统的建立过程基因芯片的检测原理是,将许多特定的寡核苷酸片段(或cDNA片段)作为靶基因,有规律地排列固定于支持物上;样品DNA通过PCR扩增掺入荧光标记分子或放射性核素作为探针,然后按碱基配对原理将两者进行杂交;再通过荧光或核素检测系统对芯片进行扫描,由计算机系统对每个探针上的信号作出比较和检测,从而得出所需要的信息。基因芯片检测的突出优点是高通量,α地中海贫血和β地中海贫血的诊断可集成于1张芯片上进行。地中海贫血的诊断基因芯片将我国人群中常见的3种缺失型α珠蛋白基因突变(特别是对HbH病)及β珠蛋白基因突变探针固定于同一张基因芯片表面,简便、省时,且无需接触放射性核素,可同时、快速、准确地检测α与β地贫基因突变,为临床提供了一种快速、有效的地中海贫血基因诊断及产前诊断方法,便于推广应用。四、血清学检测方法有文献报道,将多重PCR与磁珠悬浮阵列技术相结合,操作时间短,可一次检测100个样本,同时检测出地中海贫血基因缺失及点突变。相对于传统检测方法,该技术既方便又可减少花费,有待进一步推广。lin等利用基于实时荧光PCR的探针高分辨率熔点曲线分析技术,在40min完成对常见12种β地中海贫血基因突变的检测,具有准确、快速、高效的特点,可作为新生儿血液筛查的项目。胎儿游离dna检测技术因地中海贫血为常染色体隐性遗传性疾病,在我国地中海贫血高发地区中应推广专项婚前检查。如夫妇双方均为地中海贫血基因携带者,则应于妊娠期进行产前诊断。可于妊娠第8~12孕周吸取绒毛,妊娠第16~20孕周抽羊水分离脱落细胞,妊娠第20孕周后抽取脐带血,提取胎儿的DNA,按上述基因诊断方法(单管多重PCR技术、PCR-反向斑点杂交等)检测胎儿是否获得了地中海贫血的缺陷基因。近年来,无创产前诊断技术发展迅速,其中以胎儿游离DNA检测技术的应用最为广泛。Lin等利用PCR与导流杂交技术相结合,通过低密度基因芯片对60例孕妇成功进行了常见的3种缺失型及3种突变型α-地中海贫血和17种β地中海贫血基因突变、复合地中海贫血的产前诊断;也有研究通过该方法对141例孕妇成功进行检测。因