下瘀血汤、茵陈蒿汤、一贯煎、黄芪汤对ccl4大鼠肝硬化成型阶段的干预作用

下瘀血汤、茵陈蒿汤、一贯煎、黄芪汤对ccl4大鼠肝硬化成型阶段的干预作用

近年来，中医在肝屏障和肝硬化方面发挥着明显的优势。它不仅能改善临床症状和肝功能，提高患者的生活质量，还能抑制肝炎反应及纤维组织增生，促进肝脏钙化的逆转。体内、外实验研究表明,中药复方具有多途径的综合作用。但已往的研究只注重“病”而忽视了“证候病机”,对于针对肝硬化中医证候病机的基本治法、方剂尚无系统的比较研究,中医学的精髓——“辨证论治”的科学内涵有待深入探索。目前,中医对肝硬化病机的认识已逐渐趋向一致,综合名老中医的观点及有关临床报道,肝硬化的中医基本病机为气阴虚损、瘀血阻络、湿热内蕴等,益气、养阴、化瘀及清热利湿是常用的基本治法。基于以上认识,本研究以进展期四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)大鼠肝硬化模型为载体,紧密结合临床实际,以肝纤维化已经形成并向肝硬化发展的时期作为干预治疗的切入点,探讨临床治疗肝硬化常用的代表不同治法的经典复方(清热利湿的茵陈蒿汤、益气的黄芪汤、活血化瘀的下瘀血汤、养阴疏肝的一贯煎)对肝硬化成型阶段的干预作用及其取效的证候病机基础。材料和方法1实验动物中心Wistar雄性大鼠94只,清洁级,体重130~150g,购自中国科学院上海实验动物中心,许可证号:SCXK(沪)2003-0003。上海中医药大学实验动物中心饲养、造模和观察,自由饮食。2小柴胡汤的制备下瘀血汤、茵陈蒿汤、黄芪汤、一贯煎所含的生药均购自上海华宇药业有限公司,有明确的原产地,经生药学专家鉴定,按照原方比例和制法由上海中医药大学附属曙光医院国家中医药管理局中药制剂中心一次制备干燥后冷藏,小柴胡汤购自日本ツムラ株式会社(TJ-9颗粒剂,成人每日用量7.5g),为对照药物。CCl4分析纯和橄榄油购自中国医药集团上海化学试剂公司;肝功能测定试剂盒分别购自卫生部上海生物制品研究所及南京建成生物工程研究所;羟脯氨酸标准品购自日本ナカティテスク株式会社,批号:MIR8282。3模型准备首次以CCl43ml/kg剂量皮下注射,以后以50%的CCl4橄榄油溶液2ml/kg剂量皮下注射,每周2次,共12周。4用药干预方法造模4、8周后,随机抽取正常及模型大鼠各6只,处死作动态观察。其余模型大鼠随机分为模型对照组(10只)、下瘀血汤组(9只)、茵陈蒿汤组(10只)、黄芪汤组(10只)、一贯煎组(9只)、小柴胡汤组(9只)干预治疗。第9周开始,于继续造模的同时,药物干预组按成人(65kg)每kg体重日用量的8倍,即下瘀血汤0.36g/kg(相当于生药3.2g/kg);茵陈蒿汤0.695g/kg(相当于生药4.185g/kg);黄芪汤0.935g/kg(相当于生药4.923g/kg);一贯煎2.628g/kg(相当于生药7.938g/kg);小柴胡汤颗粒剂0.923g/kg,分别用蒸馏水10ml稀释灌胃,每日1次,共计4周。正常组(8只)与模型对照组以同体积生理盐水灌胃。5肝组织病理学检测造模12周结束,大鼠用2%戊巴比妥钠以2ml/kg体重剂量腹腔注射麻醉后,仰卧位固定,打开腹腔,观察肝脾的色、质、形态、体积等情况。经下腔静脉采血,摘取肝脾,称重,从肝右叶切取1.0cm×0.8cm×0.3cm大小肝组织1块,10%中性福尔马林固定,脱水、包埋,切片,HE及胶原染色,观察组织学变化;留取肝组织作羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)含量测定。所采血液4℃静置3h后,3000r/min×30min离心,分离血清,检测各项血清学指标。6不同年份、不同组织hyp、alb的测定6.1一般情况包括大鼠的死亡情况,体重、肝脏大体形态、肝脏及脾脏重量等。6.2肝组织切片HE及胶原染色观察肝脏组织学变化。6.3肝组织胶原纤维增生程度分期0期:正常肝脏,无明显胶原纤维增生;Ⅰ期:胶原纤维增生,中央静脉和门脉区有少量星状胶原纤维束放散,但无间隔形成;Ⅱ期:胶原纤维增生,中央静脉和门脉区结缔组织变厚,由此向四周伸出纤维索,形成不完全间隔;Ⅲ期:胶原纤维大量增生,有个别菲薄的完全间隔形成,或较厚的不完全间隔即将形成假小叶;Ⅳ期:完全纤维间隔,假小叶形成。6.4肝组织Hyp含量测定采用Jamall等的方法。6.5肝功能血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,采用赖氏法;血清白蛋白(Alb)含量,采用溴甲酚绿法;血清总胆红素(TBIL)含量,采用重氮法;血清谷氨酰转酞酶(GGT)活性,按试剂盒说明方法测定。7单因素方差分析计量资料采用统计分析软件SPSS11.5中的ANOVA程序进行单因素方差分析,q检验,并用LSD进行两两比较,等级资料采用Ridit分析。结果1组大鼠肝指数、脾指数变化情况比较药物干预治疗前模型组大鼠死亡5只,干预治疗后黄芪汤组和小柴胡汤组各死亡1只。造模初期模型大鼠体重仍有所增加,3周后逐渐下降,与同期正常大鼠比较差异有显著性(P<0.01);肝指数呈8周最高12周降低的趋势,但均显著高于同期正常组大鼠(P<0.01);脾指数逐渐增加,与同期正常大鼠比较差异有显著性(P<0.01);与12周模型对照组比较,下瘀血汤、一贯煎、黄芪汤组大鼠体重有所增加,且下瘀血汤组脾指数降低,但差异无显著性(P>0.05)。2大鼠肝脏病理组织病理学检测造模结束时正常组大鼠肝脏表面光滑,红润柔软。与正常大鼠比较,模型组大鼠肝脏缩小,呈淡黄色,表面呈小结节状改变,结节分布较均匀,质地变硬。与模型对照大鼠比较,下瘀血汤组、一贯煎组、黄芪汤组肝脏较大,呈淡黄色,表面较光滑,无明显结节状改变,质地较柔软;茵陈蒿汤组、小柴胡汤组无明显变化。3大鼠肝脏脂肪变性的比较HE染色显示正常大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列。与正常大鼠比较,4周后模型大鼠可见以中央静脉为中心的肝细胞脂肪变性,汇管区周围未受损的肝细胞呈孤立的岛状结构,可见极菲薄的胶原纤维在脂肪变性区域伸展。8周后,模型大鼠肝细胞脂肪变性累及整个肝小叶,可见较细的胶原纤维形成不完全包绕,间隔内可见较多的成纤维细胞,少量炎性细胞浸润,大胆管损害明显,小胆管增生。12周后,正常肝小叶结构消失,大量的纤维结缔组织增生,形成大小不一的典型假小叶结构,部分假小叶内可见新生幼稚的肝细胞,间隔内可见大量的成纤维细胞和炎性细胞浸润,极少见正常的胆管样结构,小胆管增生明显。与12周模型对照组比较,下瘀血汤组、一贯煎组大鼠肝细胞脂肪变性程度较轻,完整的假小叶结构少见,胆管损害程度轻,小胆管增生程度低;黄芪汤组纤维结缔组织较疏松;茵陈蒿汤组、小柴胡汤组肝组织病理无明显改善。天狼星红胶原染色显示正常大鼠仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维。4周模型大鼠胶原纤维呈星芒状在脂肪变区域伸展,中央静脉管壁明显增厚。8周模型大鼠纤维间隔增厚,少数向小叶内延伸,极少部分形成较疏松的纤维包绕肝细胞。12周模型大鼠纤维间隔增宽致密,形成大小不一的完整假小叶结构。与12周模型组比较,下瘀血汤组、一贯煎组纤维间隔明显减少,少见完整包绕假小叶结构;黄芪汤组纤维间隔较疏松;茵陈蒿汤组、小柴胡汤组无明显改善。4hyp及肝脏胶原增长率见表1。与正常大鼠比较,4、8、12周时模型大鼠肝组织Hyp含量均显著升高(P<0.01),且12周显著高于4、8周模型对照组(P<0.01)。与12周模型对照组比较,下瘀血汤组、一贯煎组、黄芪汤组Hyp含量显著降低(P<0.05,P<0.01);茵陈蒿汤组、小柴胡汤组也有一定的降低趋势,但差异均无显著性(P>0.05)。Ridit分析亦显示,模型对照组12周较4周、8周胶原增生程度显著加重;下瘀血汤组、一贯煎组、黄芪汤组肝脏胶原增生程度较12周模型对照组显著减轻;茵陈蒿汤组、小柴胡汤组差异无显著性。5对血清alb、alt、ast、见表2。与正常组比较,随着造模时间的延长,模型对照组大鼠ALT、AST、GGT、TBIL逐渐升高,12周时达到高峰,且AST、GGT、TBIL显著高于4周、8周模型对照组(P<0.01);血清Alb含量逐渐降低,12周时显著低于4、8周模型对照组(P<0.01)。与12周模型对照组比较,下瘀血汤组和一贯煎组AST、GGT、TBIL、Alb显著改善(P<0.05,P<0.01),且下瘀血汤组ALT显著降低(P<0.05);茵陈蒿汤组ALT、AST、GGT显著降低(P<0.05,P<0.01);黄芪汤组AST显著降低(P<0.05);小柴胡汤组各项指标差异均无显著性(P>0.05)。不同功效提取物中医证候病机比较本实验动态观察了CCl4诱导的肝硬化大鼠肝功能及肝组织学的变化,结果显示,4、8、12周模型大鼠血清AST/ALT比值分别为1.09、1.13与1.32,总胆红素含量4周时无明显变化,8周及12周分别增加2.13倍与4.61倍,GGT活性4周时略有上升,8周及12周分别增加5.19倍与7.78倍,血清Alb含量呈梯级降低,分别降至正常大鼠的87%、80%及66%,而反映纤维结缔组织增生的Hyp含量分别增加了0.598倍、1.36倍及3.18倍,结合肝组织学观察表明,4周模型主要表现为急性肝损伤,8周时为慢性肝损伤肝纤维化,而12周则已形成肝硬化;即8~12周这一阶段的病理改变主要表现为肝实质损伤的进一步加重与肝纤维化的快速发展,这也是本研究不同功效方剂中医证候病机的病理基础。在肝硬化成型期于CCl4继续刺激的同时,予以4种不同功效的中医方剂干预治疗(用药4周)至12周末,下瘀血汤组和一贯煎组肝组织病理改变明显减轻,肝组织Hyp含量显著下降,肝功能显著改善,其中尤以下瘀血汤的干预治疗作用为著,显示这一阶段肝内纤维结缔组织的快速增生以及由此引起的组织结构改建是下瘀血汤发挥作用、血瘀阻络方证病机的主要病理基础。而肝细胞是机体Alb的唯一合成细胞,提示这一阶段的肝实质严重受损,是养阴的一贯煎发挥效应、肝阴虚损方证病机的又一病态表现;而两个不同功效