小柴胡汤含药血清抑制hepg-2肝癌细胞增殖的机制研究

小柴胡汤含药血清抑制hepg-2肝癌细胞增殖的机制研究

小柴胡汤是由“医学圣人”张仲景创造的，是少阳启机解决的代表方剂。少阳枢机不利与肝癌的关系十分密切,是肝癌发病的重要环节。为了探讨和解枢机剂小柴胡汤抗肝癌的作用机制,本实验研究小柴胡汤含药血清对肝癌HepG-2细胞的影响。1材料表面1.1scsk/ssskspcSPF级Wistar雄性大鼠60只,体重(230±20)g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号SCSK(京)2009-0007。1.2细胞培养人肝癌HepG-2细胞系,由沈阳药科大学提供。HepG-2细胞用含10%FBSRPMI-1640培养液培养,每周换3次培养液,37℃,5%CO2培养箱内常规培养。1.3加牡蛎的药物小柴胡汤用原方剂量,柴胡120g,黄芩45g,人参45g,清半夏45g,生姜45g,炙甘草45g,根据病证结合原则和原文的加减原则,去大枣加牡蛎60g,上述药物均购于辽宁中医药大学附属医院。全部药物用2400mL水浸泡30min后煎煮40min,去药渣,再煎40min,60℃恒温条件下浓缩成1mL含生药2.46g,4℃冰箱内保存,使用前加温至37℃使用。1.4试剂1.5民法典生物显微镜3111型CO2培养箱(美国Thermo);TS100倒置生物显微镜(日本Nikon);iMark型酶标仪(美国Bio-Rad);IX71倒置荧光显微镜(日本Olympus);FACSCalibur流式细胞仪(美国BD)。2方法2.1水合氯醛麻醉大鼠按体重随机分为2组,即空白对照组,小柴胡汤组。小柴胡汤给药剂量按照正常成人临床等效剂量折算,大鼠灌服3.69g·kg-1体重,空白组给予等量蒸馏水。1次/d,连续7d。末次灌胃1h后水合氯醛麻醉,采用一次性非抗凝真空采血管从腹主动脉取血。室温静置2h,低温离心机离心,2500r·min-1,离心30min,分离血清,分离的血清同组混匀,经恒温水浴56℃灭活30min,在超净台用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后,分装,放入-80℃冰箱中保存备用。2.2细胞排列2.3胎牛血清rpmi-1330将处于对数生长期的HepG-2细胞接种在含有10%胎牛血清RPMI-1640培养液的6孔板中,培养12h后,加入空白血清和不同浓度的小柴胡汤含药血清,作用12h后,倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。2.4细胞移植抑制率=[A(空白血清组)-A(含药血清组)]/A(空白血清组)×100%2.5体外沉淀液的制备6孔板中培养的HepG-2细胞,分别经空白血清和含药血清作用8h后,分别收集细胞,1200r·min-1离心10min,PBS洗涤2次,用75%的乙醇悬浮细胞沉淀,4℃固定过夜。离心细胞,1200r·min-110min,弃上清,用500μLPBS重悬细胞沉淀,加入5μLRNaseA(1g·L-1),37℃水浴30min,加入300μLPI溶液4℃避光染色,1h后直接上机检测。2.6荧光显微镜观察在培养于24孔板中的HepG-2细胞加入空白血清和含药血清作用8h后,加入400μL(20μm·L-1)Rh123溶液,在37℃下作用20min,去除染液,用PBS小心洗2次,于激发波长为507nm,发射波长为529nm的荧光显微镜下观察并拍照。2.7统计分析采用SPSS11.0进行统计分析,计量资料采用表示,多组数据比较采用单因素方差分析中的LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1各组细胞变圆、缩张率空白血清组细胞贴壁生长良好;小柴胡汤5%含药血清组仅有少部分细胞变圆、萎缩;小柴胡汤10%含药血清组和20%含药血清组很多细胞发生了漂浮,死亡(图1)。3.2抑制作用的影响与空白血清组比较,不同浓度的含药血清在不同时间点对细胞生长均有不同程度的抑制作用(P<0.05或P<0.01),其抑制程度与含药血清浓度呈正相关(表1)。由于10%含药血清抑制细胞生长作用具有时间依赖的特点,因此,选取10%含药血清进行后续实验。3.3含药血清对患者细胞凋亡的影响流式细胞仪检测发现,HepG-2细胞经小柴胡汤含药血清作用8h后,与空白血清组比较,凋亡率从6.78%上升至19.51%,细胞凋亡率显著增加,说明含药血清可以诱导该细胞发生凋亡(图2)。3.4rh2013年8h后细胞线粒体膜电位荧光强度与空白血清组比较,小柴胡汤含药血清作用8h后,Rh123标记的细胞线粒体膜电位荧光强度明显减弱,初步证明药物诱导细胞凋亡通过了线粒体途径(图3)。4免疫活性成分检测目前研究认为小柴胡汤具有体外抑制人肝癌细胞HepG-2增殖的作用,其可溶性成分能够抑制人肝胆系癌细胞株的细胞周期G0/G1期。本研究结果表明,小柴胡汤含药血清干预HepG-2细胞后,能够显著抑制细胞增殖,并呈现一定的时间-剂量依赖性的特点。凋亡与肿瘤的发生、发展和治疗密切相关,利用有关的凋亡诱导和调控机制诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的一个重要途径。本研究结果表明,流式细胞术检测凋亡率升高,说明小柴胡汤含药血清诱导细胞发生了凋亡。经典的凋亡途径是指死亡受体途径和线粒体途径,其调控可通过死亡受体、线粒体、凋亡抑制蛋白等多个水平实现,也受相关传导通路信号的调节。现代研究表明,雷帕霉素显著抗肝癌细胞增殖,并通过活化caspase-3和破坏线粒体膜电位诱导细胞凋亡。黄芩属提取物能够抑制肝癌H22细胞增殖,其机制与线粒体膜电位的损伤相关。珍珠梅提取物能够通过线粒体途径诱导HepG-2肝癌细胞凋亡。异东方蓼黄素诱导HepG-2肝癌细胞凋亡,凋亡可能通过线粒体功能障碍和PI3K/Akt信号通路被介导。Rh123能特异性地将具有活性功能的线粒体染色,呈现绿色荧光,因此荧光强度不仅反映了具有活性功能的线粒体的数量,而且反映了线粒体的功能强弱。Rh123是由线粒体吸收的阳离子亲脂染料,其摄取量与线粒体膜电位呈正相关。本实验研究采用Rh123荧光染色观察线粒体膜电位的变化,结果显示,小柴胡汤含药血清组能够降低线粒体膜电位,说明线粒体内膜电位差被破坏,或者没有足够的电位差,ATP合成酶就无法产生足够的能量,细胞在无能量供给的情况下无法维持正常的生理状态,促使细胞死亡。实验初步证实了小柴胡汤含药血清诱导了HepG-2肝癌细胞凋亡,线粒体途径参与了该过程,其分子机制有待进一步研究。细胞分为10%空白血清组、5%含药血清组、10%含药血清组、20%含药血清组。用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含l0%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成细胞悬液,进行细胞计数,以每孔1×104个细胞100μL分别接种于3块96孔培养板中,每组5个复孔。培养12h后,将各孔培养液吸出,分别加入100μL空白血清和不同浓度的含药血清,周围用100μLPBS溶液封闭,将培养板放入CO2培养箱,在37℃5%CO2及饱和湿度条件下,分别培养6,12,24h。孵育后,