长白山野生斑玉孢生物学特性的研究

长白山野生斑玉孢生物学特性的研究

由于栖息地破坏、污染、过度使用、外来物种入侵和疾病流行等原因，所有生物的生存都受到影响。为此,很多国家对本国的真菌(或某些类群)状况进行了不同程度的评估,有的已经列出红色名录[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。而在我国除了冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora)、松茸(Tricholomamatsutake(S.Ito&S.Imai)Singer)等少数真菌以外,更多真菌的生存状态几乎未被关注,或者仅处于被认识的初始阶段。斑玉蕈为担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、玉蕈属(Hypsizygus)真菌,分布于中国东北、云南等地;美国、加拿大和日本也有分布。斑玉蕈生于槭树(Acerspp.)树树干(有损伤的部位)上,为优良食药兼用菌,已有人工栽培。但野生种群分布稀少,已被列入极危种。笔者通过对分布于长白山的优质食用菌斑玉蕈(Hypsizygusmarmoreus(Peck)H.E.Bigelow)的生物学特性的研究,欲揭示该真菌的濒危机理,以便推动其他珍稀物种的保育研究。1材料和方法1.1菌种获得和保存供试菌株:野生斑玉蕈子实体采自吉林省长白山自然保护区,采用PDA培养基,组织分离法获得菌种。菌种保存于吉林农业大学菌物所。孢子印及孢子悬液:栽培子实体制作无菌孢子印,将剪刀灭菌后剪取部分孢子印置于无菌水中,并稀释为适宜的孢子密度(400倍显微镜下每视野孢子数量20个左右)。1.2培养基用碳源利用试验营养条件对菌丝生长的影响:基础培养基为碳源(以2%葡萄糖的含碳量为标准)+氮源(以0.2%蛋白胨的含氮量为标准)+水。分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乙醇、麦芽糖作为基础培养基中的碳源进行碳源利用试验。分别用蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NaNO2、KNO3作为基础培养基中的氮源进行氮源利用试验。将各处理的培养基分别加入100mL三角瓶内,每瓶25mL,高压灭菌、冷却后,以直径5mm打孔器定量接种。采用液体静止培养的方法,于25℃黑暗条件下培养,第15天称量菌丝干质量,比较不同的碳(或氮)源对菌丝生长的影响,每个处理3次重复。pH值对菌丝生长的影响:用1.0mol/LHCl和1.0mol/LNaOH分别调节基础培养基的pH值至3、4、5、6、7、8、9、10、11。其他处理同碳源利用试验。温度对菌丝生长的影响:将培养料(棉籽壳5g+水6g)均匀装入试管中,高压灭菌、冷却后接种。设5、10、15、20、25、30、35℃共7个梯度,黑暗条件下培养,观察不同温度对菌种萌发、菌丝生长和子实体原基发生的影响,从菌丝开始吃料起(9d)每隔3d观测菌丝生长量,共测量6次,取平均值,根据菌丝生长速度和生长势确定菌丝最适生长温度,每个处理重复3次。培养料含水量对菌丝生长的影响:将棉籽壳5g分别加入不同体积的水,调含水量为45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%共7个梯度,均匀装入试管中,高压灭菌、冷却后接种高粱菌种。于25℃黑暗条件下培养,观察不同含水量对菌种萌发、菌丝生长的影响,从菌丝开始吃料起(9d)每隔3d观测菌丝生长量,共测量6次,取平均值,根据菌丝生长速度和生长势确定菌丝生长的最适含水量,每个处理重复3次。孢子萌发条件:将斑玉蕈的新鲜孢子悬液接在蒸馏水和葡萄糖蛋白胨培养基中,观察孢子萌发情况;将斑玉蕈的新鲜孢子悬液分别经50、60、70、80℃热处理10min后,接在蒸馏水和葡萄糖蛋白胨培养基中,观察孢子萌发情况。子实体发生发育条件:采用袋栽法进行子实体栽培试验,每袋装干料250g,经高压灭菌、冷却后接高粱菌种。培养料配方为:棉籽壳98%、石灰粉1%、石膏粉1%,含水量65%。2结果与分析2.1氮源利用试验结果碳源利用试验结果(表1)表明,斑玉蕈菌丝在供试碳源中均可以生长,方差分析结果表明其利用可溶性淀粉的效果最好,蔗糖次之,麦芽糖、乙醇、葡萄糖表现较差。因此推断,斑玉蕈菌丝利用大分子糖的能力较强,对单糖及醇类的利用能力较差。氮源利用试验结果(表2)表明,除了NaNO2,斑玉蕈菌丝在供试氮源中均可以生长,方差分析结果表明其利用蛋白胨的效果最好,(NH4)2SO4表现次之,其他2种差异不大。因此,斑玉蕈菌丝利用有机氮的能力最强,利用铵态氮的能力次之,对硝酸盐及尿素的利用效果最差。此外,NaNO2对斑玉蕈菌丝有明显的毒害作用,菌种根本无法萌发。2.2ph值、温度和接种量对斑玉蚤生长的影响pH值试验结果表明,pH值为3时,菌丝不能生长,pH=4～11时菌丝干质量分别为:0.0148、0.0230、0.0188、0.0154、0.0142、0.0127、0.0058、0.0040g。可见,菌丝生长的pH值范围比较广泛,但更适于偏酸性环境,最适pH值为5。温度试验结果表明,斑玉蕈菌丝在10、15、20、25、30℃条件下的生长速率分别为:0.083、0.187、0.207、0.234、0.160cm/d。可见,25℃为菌丝生长的最适温度。培养料含水量对菌丝生长的结果(表3)表明:菌丝在培养料含水量为45%～70%时均可以生长,但综合考虑菌丝生长速率和菌丝长势,60%～65%为菌丝生长的最佳含水量。当培养料含水量达到75%时,菌丝无法生长。2.3热处理培养过程中全保健酸发酵剂的萌发斑玉蕈的新鲜孢子在蒸馏水、葡萄糖蛋白胨培养基中未见萌发,分别经50、60、70、80℃热处理10min后接于蒸馏水、葡萄糖蛋白胨培养基上仍未见萌发。其孢子萌发有可能需要一定时间的后熟或其他特殊环境条件的刺激。2.4子实体原基co/o2发育的影响在所有的温度处理中,只有恒温20℃的处理有子实体原基产生,将所有温度处理的材料统一置于18～22℃的黑暗环境条件下,15d后陆续产生原基。这说明斑玉蕈子实体原基发生的温度范围为20℃左右。但原基发育对湿度要求较高,原基很容易在湿度较小的环境中枯萎,丧失活力。试验中发现,在栽培的菌袋面对窗口的一面子实体原基发生数量明显多于背向窗口的一面。说明光线虽然不是子实体原基发生的必要条件,但是一定强度的散射光可以增加原基发生的数量。另外,观察发现斑玉蕈子实体的发育也有明显的向光性。CO2/O2对子实体原基发育的影响与冬菇(Flammulinavelutipes(Curtis)Singer)等食用菌相似。斑玉蕈子实体原基的正常发育需要一定体积分数的O2,如果CO2体积分数过高会导致菌柄徒长而菌盖不分化。因此,子实体原基要顺利的发育为正常的子实体需要一个通气良好的环境。斑玉蕈孢子弹射量与子实体成熟程度关系密切,开伞之后一直到菌盖边缘完全平展之前需要5～7d,这段时间孢子弹射量很小,菌盖边缘完全平展后孢子弹射量会突然增加。3斑玉蚤的人工诱导与生长菌丝营养特性研究表明,斑玉蕈菌丝利用大分子糖的能力较强,而对小分子的单糖利用率较低;利用有机氮的能力最强,利用铵态氮的能力次之,对硝酸盐及尿素的利用效果最差。对菌丝生长的环境条件研究表明,斑玉蕈菌丝生长的最适温度是25℃,最适pH值为5,最适培养料含水量为65%。在斑玉蕈菌丝生物学特性方面,未发现明显制约其营养生长的因素。斑玉蕈对基物选择范围决定了其所能占有的资源的多少。斑玉蕈生于槭树树干(有损伤的部位),而且多生于枯立木上,其所能够利用的资源十分有限,这对其种群的健康发展是一个比较大的障碍。斑玉蕈在常规条件下及高温刺激下仍无法萌发,可能是由于其孢子的休眠,也可能是由于其孢子萌发需要更加特殊而苛刻的环境条件所致。总之,其孢子难以在常规条件下萌发是其种群稀少的可能因素之一。斑玉蕈原基发生数量较多,但原基发育对湿度要求较高,原基很容易在湿度较小的环境中枯萎,丧失活力。从子实体原基发生到子实体完全成熟需要7～10d,这期间一直需要较高的湿度环境才能确保子实体成熟并大量弹射孢子。因此,其大量弹射孢子对高湿度环境的长时间依赖性是其生活史各环节相互衔接的一个重要的制约因素。此外,野外调查中发现斑玉蕈子实体多发生于保存完好的原始天然林,而人工林和次生林中尚未发现。20世纪70年代以来大规模的森林采伐使得原始天然林的面积锐减。目前,斑玉蕈在中国东北只有长白山区和大、小兴安岭有分布。以上几方面的原因导致斑玉蕈野生种群分布狭小且数量稀少,甚至处于极危状态。因此,应在进一步加强其生态调查研究的同时主要保护斑玉蕈的生存环境以及其生长的基物,为其种群的恢复提供基本的物质基础。对其确切已知的分布点做定位研究,对分布点及附近区域的生态环境进行整体保护。目前,斑玉蕈人工栽培技术已经趋于成熟,长白山斑玉蕈在吉林长春和新疆阿拉尔地区均获得大