第三章 液相色谱法

第三章液相色谱法第1页，课件共87页，创作于2023年2月2第2页，课件共87页，创作于2023年2月3液相色谱仪（2）第3页，课件共87页，创作于2023年2月4液相色谱仪（3）第4页，课件共87页，创作于2023年2月5北京瑞利第5页，课件共87页，创作于2023年2月6

§3-1概述高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率

和实现了自动化

操作。

高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.第6页，课件共87页，创作于2023年2月7高效液相色谱经典色谱第7页，课件共87页，创作于2023年2月8经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.5

107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。第8页，课件共87页，创作于2023年2月9和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。

液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。

§3-1概述一、液相色谱分离原理及分类第9页，课件共87页，创作于2023年2月10液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。

§3-1概述

根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。第10页，课件共87页，创作于2023年2月11二、液相色谱与气相色谱的比较

液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：第11页，课件共87页，创作于2023年2月12气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70~80%。

二、液相色谱与气相色谱的比较（1）应用范围不同第12页，课件共87页，创作于2023年2月13

因为：①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。

二、液相色谱与气相色谱的比较（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作第13页，课件共87页，创作于2023年2月14②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。

③液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。二、液相色谱与气相色谱的比较第14页，课件共87页，创作于2023年2月15（3）由于液体的扩散系数比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。二、液相色谱与气相色谱的比较第15页，课件共87页，创作于2023年2月16

综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。

§3-1概述第16页，课件共87页，创作于2023年2月17§3–2高效液相色谱仪第17页，课件共87页，创作于2023年2月18§3–2高效液相色谱仪高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。第18页，课件共87页，创作于2023年2月19贮液器高压泵检测器梯度淋洗装置色谱柱压力表进样器馏分收集器高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统第19页，课件共87页，创作于2023年2月20高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统第20页，课件共87页，创作于2023年2月21第21页，课件共87页，创作于2023年2月22

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：由储液罐、高压输液泵**、过滤器、压力脉动阻力器等组成。

对高压输液泵的要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。1.高压输液系统§3–2高效液相色谱仪第22页，课件共87页，创作于2023年2月23常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。§3–2高效液相色谱仪恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍恒流泵分机械注射泵和机械往复泵**两种第23页，课件共87页，创作于2023年2月24高压输液泵：主要部件之一，压力：150～450×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。第24页，课件共87页，创作于2023年2月252．进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5-30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

第25页，课件共87页，创作于2023年2月26

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：第26页，课件共87页，创作于2023年2月27准备状态进样状态流动相入口色谱柱入口样品出口样品入口流动相入口色谱柱入口样品环第27页，课件共87页，创作于2023年2月283分离系统——色谱柱

色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技术的性能不受影响。第28页，课件共87页，创作于2023年2月29柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。

对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速度快等。

第29页，课件共87页，创作于2023年2月30第30页，课件共87页，创作于2023年2月31使用色谱柱注意事项：1溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，防止堵塞。2加前置柱。3更换流动相要渐变。4用后要保护好。第31页，课件共87页，创作于2023年2月324．检测系统

HPLC与GC一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线性范围宽等优点检测器分为两大类：一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:第32页，课件共87页，创作于2023年2月33HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。高效液相色谱检测器：（1）紫外光度检测器（UV）优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量10-9g·mL-1。第33页，课件共87页，创作于2023年2月34高效液相色谱检测器：（1）紫外光度检测器（UV）缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。第34页，课件共87页，创作于2023年2月35光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第35页，课件共87页，创作于2023年2月36

检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵敏度越高，灵敏度可达10-7g·cm-3。通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（3）荧光检测器（4）电导检测器

（2）示差折光率检测器第36页，课件共87页，创作于2023年2月37它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置.HPLC梯度淋洗与GC中的程序升温一样。

对于某些复杂样品，组分的k′范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。就是组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、pH、离子强度、通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因子和tR，提高分离效果和分析速度。5、附属系统第37页，课件共87页，创作于2023年2月38梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第38页，课件共87页，创作于2023年2月上节课内容回顾液相色谱特点液相色谱仪的组成高压输液系统进样系统分离系统检测系统第39页，课件共87页，创作于2023年2月403-3高效液相色谱的固定相和流动相（－）固定相

高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。

固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。第40页，课件共87页，创作于2023年2月411.表面多孔型固定相

它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。

这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。

第41页，课件共87页，创作于2023年2月422．全多孔型固定相它由直径为10µm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析.第42页，课件共87页，创作于2023年2月43（二）流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表中列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。第43页，课件共87页，创作于2023年2月44

对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。第44页，课件共87页，创作于2023年2月45（3）高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～100

nm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.第45页，课件共87页，创作于2023年2月46流动相及流动相的极性

（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。第46页，课件共87页，创作于2023年2月47流动相组成

流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第47页，课件共87页，创作于2023年2月481.吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在载体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。3-4高效液相色谱法的主要类型及选择HPLC根据分离机理的不同分为几种类型：第48页，课件共87页，创作于2023年2月49高效液相色谱法的主要分离类型3.离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；第49页，课件共87页，创作于2023年2月503-4高效液相色谱法的主要类型及选择一、液一液分配色谱法（LLPC）

在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。1．分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。第50页，课件共87页，创作于2023年2月51

2、固定相

由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液β，β′一氧二丙腈，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。详细介绍见后。

第51页，课件共87页，创作于2023年2月523．流动相

在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。

如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。

如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。

第52页，课件共87页，创作于2023年2月53二、化学键合相色谱法（CBPC）

采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。

由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。第53页，课件共87页，创作于2023年2月541．键合固定相类型用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等.第54页，课件共87页，创作于2023年2月552．反相健合相色谱法

此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇—水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等。

它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。

第55页，课件共87页，创作于2023年2月563.正相键合相色谱法

此法是以极性的有机基团，CN、NH2双羟基等键合在硅胶表面作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。

这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。第56页，课件共87页，创作于2023年2月574.离子性键合相色谱法

当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H一CH2NH2、－C00H等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。

以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有80％的分离问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。第57页，课件共87页，创作于2023年2月58

第58页，课件共87页，创作于2023年2月59三、液一固吸附色谱法(LSAC)

液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。1．分离原理当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，与流动相溶剂分子（S）在固定相表面发生竞争吸附:X+nS吸附=X吸附+nS第59页，课件共87页，创作于2023年2月60

X+nS吸附=X吸附+nS达平衡时，有其中K为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。K值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。K值可通过吸附等温线数据求出。第60页，课件共87页，创作于2023年2月612．固定相吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。第61页，课件共87页，创作于2023年2月623、流动相一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。第62页，课件共87页，创作于2023年2月63四、离子交换色谱法（IEC）此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。第63页，课件共87页，创作于2023年2月641．离子交换原理

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A第64页，课件共87页，创作于2023年2月65

2．固定相作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）第65页，课件共87页，创作于2023年2月66第66页，课件共87页，创作于2023年2月673．流动相离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）水的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低PH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。

第67页，课件共87页，创作于2023年2月68五、凝胶色谱法（SEC）

凝胶色谱法又称尺寸排阻色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。

尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。第68页，课件共87页，创作于2023年2月69

1．分离原理

凝胶色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质——凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图：第69页，课件共87页，创作于2023年2月70第70页，课件共87页，创作于2023年2月聚合物溶液进入色谱柱后，由于浓度差，所有溶质分子都力图向凝胶表面孔穴渗透。体积较小的分子——既能进入较大的孔穴，也可以进入较小的孔穴，向孔内扩散的较深；体积较大的分子——只能进入较大的孔穴；体积更大的分子——不能进入孔穴，只能从凝胶的空隙流过。第71页，课件共87页，创作于2023年2月聚合物试样进入色谱柱后处于溶剂的淋洗之下：1)高分子量级分在柱内停留时间很短，很快就被溶剂淋洗出来；2)分子量中等级分在柱内的停留时间较长，它们随淋洗液缓慢的带出；3)分子量最小的级分在柱内的停留时间最长，最后被溶剂淋洗出；按照淋出的先后顺序，依次收集到分子量从大到小的各个级分，从而达到对聚合物分级的目的。第72页，课件共87页，创作于2023年2月732．固定相

排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。

所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。（1）软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。

（2）半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。第73页，课件共87页，创作于2023年2月743．流动相

排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，溶剂也必须能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小。选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。第74页，课件共87页，创作于2023年2月二、GPC结构和仪器工作示意图试样和溶剂注入系统，主要包括：溶剂储槽、脱气室、过滤器、精密计量泵、进样装置；色谱柱系统，包括柱温控制箱；检测系统——各种检测器（RI、UV等）；数据处理系统（包括模数转换器、计算机、打印机/绘图仪等）；控制系统。第75页，课件共87页，创作于2023年2月第76页，课件共87页，创作于2023年2月溶剂的选择在凝胶色谱分离中,溶剂是流动相，它的作用没有其他液相色谱重要。样品中不同分子量级分的分离并不依赖于溶剂与样品之间的相互作用力。因此溶剂的选择主要是从对样品的溶解能力,溶剂与仪器的匹配以及实验结果处理的方便来考虑。第77页，课件共87页，创作于2023年2月2、色谱柱系统包括参与柱、分离柱和柱温控制箱。色谱柱是一支内部装有凝胶填料的不锈钢管。柱内凝胶材料的选择很重要，要有较高的分离效果、良好的化学稳定性、热稳定性，同时还要求有较好的机械强度和低流动阻力。交联PS凝胶——适用于非极性有机溶剂。多孔硅胶——化学惰性、热稳定性、机械强度好、可以在柱中直接更换溶剂。多孔玻璃——水溶液体系第78页，课件共87页，创作于2023年2月凝胶色谱柱的选择1）根据渗透极限和分离范围进行选择；通常可采用搭配柱子的方法,将不同规格的凝胶柱串联起来,可以起到更好的分离效果；2）根据溶剂体系——水溶性/油溶性；3）考虑凝胶的热稳定性、机械强度和化学惰性差。第79页，课件共87页，创作于2023年2月3.检测系统检测器的作用是将色谱柱淋出液中样品的组成、含量的变化转化为可供检测的信号，从而完成定性、定量的判断分离情况的任务。用于GPC的检测器很多，包括：示差折光检测器——适用于所有聚合物的检测；紫外/红外检测器——适用于对该检测器有特殊响应的聚合物。自动馏分收集器——自动计算出淋出液的体积；由此得到随