荧光分析中几种常用溶剂的拉曼散射光

荧光分析中几种常用溶剂的拉曼散射光

溶剂的散射光对荧光分析有显著影响，通常是其灵敏度的重要限制因素。其中拉曼散射光由于其波长随激发光的变化而改变,且与荧光波长相近,因此对荧光分析的影响较大。早在1959年,C.A.Parker等就研究了水、乙醇、氯仿、四氯化碳和环已烷五种常用溶剂的拉曼光谱,描述了高压汞灯光源不同激发光波长(248、313、365、405和436nm)照射时的拉曼峰位置,提出包含氢原子的溶剂如水、乙醇和环已烷拉曼光的频率随激发光的频率而异,但频移保持在约0.3μm-1。并研究了溶剂拉曼散射光对0.1μg/ml硫酸奎宁荧光光谱的干扰。但这方面的后续研究较少,且实验数据不全。本研究探讨了荧光分析中水、乙醇、氯仿和四氯化碳四种溶剂在200～800nm不同激发光照射下拉曼散射光波长及强度的变化规律,导出不同激发光照射时,拉曼光波长λRaman与激发光波长λex及频移Δσ的函数关系。应用该公式可以计算出溶剂拉曼峰的位置,从而为荧光分析中激发光谱和荧光光谱的校正、为定量分析时激发波长和发射波长的选择起到重要的指导作用。将本研究数据和结论应用于维生素B2的荧光分析,可指导拉曼峰的确认、拉曼散射干扰的消除及最佳测定波长的选择。1材料和方法1.1英样品池和英样品池岛津RF-540荧光分光光度计,石英样品池。实验试剂乙醇、氯仿、四氯化碳均为分析纯试剂,水为二次蒸馏水(电导率ρ<1.0μs/cm)。1.2激发光与曼峰频移值的测定扫描测定水、乙醇、氯仿、四氯化碳四种溶剂在不同激发光照射下的发射光谱,记录主要拉曼峰的波长及强度,计算激发光与拉曼峰的频移值。荧光光谱扫描条件为:高灵敏度档,激发光和荧光狭缝宽度均为5nm,光谱未经过校正。2结果与讨论2.1拉索散射频移的峰位置拉曼光谱中常用散射光波数σ相对于激发光波数σ0的偏移即拉曼频移Δσ表示拉曼峰的位置。拉曼散射频移Δσ对应于分子的振动能级差,其不随激发光频率而变化,只决定于散射物质的性质。对于给定的一种物质,同一拉曼峰与激发光的频率差值是固定的常数值。表1为荧光分析中不同激发光照射下水、乙醇和氯仿的拉曼散射数据。2.1.1水的拉伸检测由表1可知,在不同的激发光波长区间得到不同频移的拉曼峰。λex=225～450nm,检测到水的拉曼频移Δσ平均值为0.348μm-1,在λex=525～800nm,Δσ平均值为0.172μm-1,在λex=475、500nm时,可同时检测到Δσ为0.348μm-1和0.172μm-1的两个强度相近且强度很小的拉曼峰。2.1.2拉拔稳定性分析乙醇分子在短波长225～500nm激发光照射下,可检测到Δσ平均值为0.306μm-1的拉曼散射峰;在λex=500～800nm时,拉曼频移Δσ为0.150μm-1;在λex=500nm时,可同时检测到上述两个拉曼峰;在λex=550～800nm时,还可同时检测到频移Δσ=0.075μm-1的又一拉曼散射峰。2.1.3拉伸散射频移氯仿在激发光λex=200～275nm时,未检测到拉曼散射,在λex=300～475nm,拉曼散射频移Δσ平均为0.307μm-1,500～575nm时,未见拉曼峰,λex=600～800nm时,拉曼散射频移Δσ平均为0.155μm-1。2.1.4拉拉克氏山的瑞利峰和拉伸峰四氯化碳的散射光谱比较特殊,λex=200～250nm时未检测到瑞利峰和拉曼峰,275nm以后才可以观察到瑞利峰。当将激发光和荧光狭缝宽度均调窄为2nm时,才可在瑞利峰后检测到很小的拉曼散射峰。由于两峰距离很近,且部分重叠,无法确定拉曼峰波长。2.2不同溶剂的拉伸峰(1)总结上述实验结果,得出不同激发光照射下,水、乙醇和氯仿的拉曼频移值,见表2。文献给出了激发光为248、313、365、405和436nm时的拉曼峰位置,与其相比,本文描述了从200～800nm范围内每间隔25nm不同激发光波长时的拉曼峰位置。在225～500nm范围内,本文检测到与文献相一致的平均频移约0.3μm-1的拉曼峰,但未能检测到文献中描述的乙醇为0.15μm-1、氯仿为0.07μm-1的第二个拉曼峰。分析其可能的原因:文献所用光源是高压汞灯,在以上特定波长处光强度很大,而目前荧光仪器多用氙灯,光强度比较均匀且相对较低。另外,第二个拉曼峰强度本身很弱,在此条件下很难检出。因此,可以不考虑该峰对荧光分析的影响。并且这一实验结果经不同实验室及仪器进行验证,结果一致。(2)由频移Δσ的定义:Δσ=1λex−1λRamanΔσ=1λex-1λRaman,可以导出拉曼峰波长与激发光波长的关系如下:λRaman=λex1−Δσ⋅λexλRaman=λex1-Δσ⋅λex。由该式可以方便地计算出不同激发波长时的拉曼峰波长(说明:式中Δσ单位为nm-1)。(3)由文献可知水、乙醇、氯仿和四氯化碳的紫外截止波长分别为191、210、245和265nm,溶剂在接近或者短于其紫外截止波长时,对光有强的吸收。在本研究中,水和乙醇在λex为200nm处未见散射峰;氯仿在λex为250nm及其之后,开始检测到瑞利散射峰;四氯化碳在λex为275nm及其之后,开始检测到瑞利散射峰,这些数据与溶剂的紫外截止波长一致。(4)水、乙醇和氯仿3种溶剂的拉曼峰相对强度变化情况见图1。由图可知,就同一溶剂而言,紫外区光激发时,溶剂拉曼散射频移约为0.3μm-1,相对强度较大,且在λex为275～300nm区间强度最大。而长波长区激发时,拉曼频移约为0.17μm-1(乙醇、氯仿为0.15μm-1),强度仅为紫外区的1/10或更小。由此可以看出,短波长光激发时的拉曼散射对荧光分析的影响程度较为严重。就不同溶剂而言,3种溶剂的拉曼光强度随激发光波长的变化趋势相似,3种溶剂的拉曼光强度顺序为:乙醇>水>氯仿。乙醇拉曼光强度约为水的2倍以上,氯仿的拉曼光强度较小,约为水的1/2。乙醇频移为0.075μm-1的拉曼峰强度与水相近。由此看出,氯仿对荧光分析的影响比水和乙醇小,乙醇的影响最大。由于光源、分光系统、样品池及检测器等仪器因素的影响,不同仪器得到的拉曼峰强度可能会稍有差别,其中所用样品池材质的影响尤为明显。2.3拉伸散射光对c以荧光分析水溶液中维生素B2为例,观察溶剂的拉曼散射光及其对荧光分析的影响:(1)荧光光谱:分别在激发光波长为400nm和425nm处,扫描0.05mg/L维生素B2水溶液的荧光光谱,见图2。由图可见荧光峰在522nm处。当激发光波长为400nm时,在463nm处还可检测到一小峰,由前述拉曼峰的研究,可判定其为溶剂水的拉曼峰。(2)激发光谱:维生素B2水溶液在发射光波长为522nm时扫描激发光谱,见图3。由图可以得到最大激发光波长为450nm。(3)拉曼散射光对荧光光谱的影响:图4A、B为λex=425、450nm时,0.01mg/L维生素B2水溶液的荧光光谱,C、D分别为λex=425、450nm时,溶剂水的拉曼散射峰。由图可知,不同波长激发光照射下的荧光光谱形状不相同,λex=425nm时,溶剂拉曼峰明显干扰荧光光谱,但是仍可分辨出拉曼峰和荧光峰。而当λex=450nm时,拉曼峰与荧光峰重合,所观察到的最大峰实际上是拉曼峰与荧光峰的叠加,其位置由522nm移至530nm。荧光光谱的峰形和强度都受到溶剂拉曼散射的影响而发生改变。(4)拉曼散射光对激发光谱的影响:图5A、B为λem=522、550nm时,0.01mg/L维生素B2水溶液的激发光谱,C、D为λem=522、550nm时,溶剂水的拉曼散射峰。由图可以看出,激发光谱图A、B的最大峰都是荧光峰与溶剂拉曼散射峰的叠加峰。激发光谱的形状受到溶剂拉曼散射的影响而有所改变。由上述可知,在荧光分析中溶剂的拉曼散射对稀溶液荧光分析的激发光谱和荧光光谱均有影响,明显干扰荧光分析。若在荧光分析时,已知溶剂拉曼散射峰的位置,有助于对荧光光谱和激发光谱谱图的分析,可以快速、准确地判定散射光,选择到合适的激发波长和发射波长。如维生素B2测定时,选择激发光为450nm时,由前述公式可计算出其拉曼峰的波长为533.5nm,与522nm的荧光峰有重合(见图4B),将干扰荧光光谱及荧光强度,而选择425nm为激发波长,可消除拉曼散射对荧光测定带来的影响。3不同溶剂对拉伸光和波长的影响由以上实验结果和讨论,可得到如下结论:(1)由拉曼光波长λRaman与激发光波长λex及频移Δσ的函数关系,可以计算出在一定激发光照射时水、乙醇和氯仿的拉曼峰波长位置,为拉曼光的确定及荧光定量分析时激发光和荧光波长的选择提供依据。(2)当激发光在紫外光区