乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原的研究

乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原的研究

隐形病是一种由条件引起的深度真菌病。它的病因是新的隐形病，主要累及中枢神经系统和肺，尤其是中枢神经系统感染。此病无明显的年龄、性别的倾向性,一些慢性病患者,如糖尿病、白血病、晚期肿瘤、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)及器官移植患者常伴发此病。长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素和抗肿瘤药物治疗的患者,因其免疫功能低下也易发此病。传统的诊断方法主要依据培养和镜检,但在发病的早期镜检可呈正常,而培养方法不仅耗时,且阳性率较低,故在一定程度上延误该病的诊治。因此,提高诊断水平,寻找一种快速、灵敏、特异的早期检测深部隐球菌感染的方法极其重要。本研究应用乳胶疑集试验检测新生隐球菌荚膜多糖抗原,探讨其对隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎的早期诊断价值。材料和方法一、病例选择1.隐球性私家车感染24例病例来自2005年1月至2006年4月广州市3家医院,根据病史、临床症状、体征、实验室检查和病原学检查(墨汁涂片或培养阳性)以及抗生素和抗结核药物治疗无效,改用抗真菌药物治疗有效,确诊为隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎者入选。男13例,女11例,年龄11～87岁。在24例患者中3例为AIDS合并隐球菌感染,1例血液病合并脑隐球菌感染。所有标本的留取均在用抗真菌药物之前。2.血清和球基血液新生隐球菌组:经临床确诊隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎患者24例,用于乳胶凝集试验检测的血清、脑脊液和肺泡灌洗液共26份(1例患者同时留取血清和肺泡灌洗液,另1例患者同时留取血清和脑脊液);用于培养和镜检检测的标本各24份(脑脊液20份、肺泡灌洗液1份、痰3份)。非隐球菌组:标本分别来自173例患者的血清、脑脊液、痰和肺泡灌洗液,其中念珠菌组经临床确诊为深部念珠菌感染患者50例,细菌组为细菌感染且无真菌感染患者31例,怀疑隐球菌组为怀疑隐球菌感染患者62例,正常组为健康献血员30名。二、方法1.可溶性抗原检测法国PASTOREXCRYPTOPLUS的免疫试剂盒,该试剂盒是采用免疫凝集原理,用红色乳胶颗粒包被抗隐球菌可溶性抗原单克隆抗体,定性或半定量测定血清、脑脊液、支气管肺泡灌洗液和尿液中隐球菌可溶性抗原。2.alrtfa血培养瓶脑脊液和血液标本3～5mL接种到BacT/ALERTFA血培养瓶,阳性标本接种沙堡弱葡萄糖琼脂(SDA)培养基35℃培养2～5d;痰标本接种SDA培养基35℃培养5d。3.显微镜检查墨汁染色:镜检1～3次,直到找到隐球菌。革兰染色:镜检3次,找到蓝色的菌体和无色的荚膜。种试验方法的特异性度乳胶疑集试验灵敏度最高达96.2%,培养灵敏度最低为70.8%,而3种试验方法的特异度无明显差异。在非隐球菌组中,念珠菌组、怀疑隐球菌组和正常组的假阳性率均为0.0%,细菌组假阳性率为3.2%(1/31)。见表1、2。诊断的假阳性和假阴性隐球菌荚膜多糖是重要的致病物质,可使机体免疫抑制,对免疫受损患者[如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者]不仅极易致肺隐球菌感染,而且亦容易全身播散。由于脑脊液中缺乏正常血清中所含有的补体和抗隐球菌生长因子,所以隐球菌性脑膜炎的发生率很高,病死率可达20%～30%,故乳胶凝集试验在深部隐球菌感染早期的诊断学意义成为近年来关注的热点。隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎的临床表现缺乏特异性,早期常误诊,不少患者起始当炎症和结核治疗,部分病例当肺癌或脑肿瘤手术后才确诊。张晓红等统计分析137例隐球菌性脑膜炎患者的误诊及预后,结果误诊疾病达34种,每1例被先后误诊1～4年,其中误诊2种以上疾病的有22例,误诊时间的长短直接影响预后。赖国祥等报道,67例隐球菌肺炎患者在确诊前均被不同程度地误诊为其他疾病,误诊率为100%。本组24例病例中有4例诊断为隐球菌肺炎,2例确诊前误诊为肺结核伴细菌性肺炎;7例培养阴性中,4例隐球菌性脑膜炎患者培养阴性,3例隐球菌肺炎患者培养阴性;4例镜检阴性。有2例在发病的早期2次脑脊液墨汁染色镜检均为阴性,但乳胶凝集试验为阳性,第3次脑脊液墨汁染色镜检才找到隐球菌。虽然脑脊液墨汁染色镜检是诊断隐球病直接而快速的诊断方法,然而在发病的初期,墨汁染色镜检往往1～3次常呈阴性,需要反复多次检查才能找到隐球菌。据文献报道,有病例在第6次脑脊液墨汁染色镜检才找到隐球菌。出现假阴性的原因一方面可能是发病早期病原学检出率低,另一方面穿刺部位对检出阳性率也有影响,隐球菌主要集中在脑膜或脑室脉络丛肉芽肿中细胞内,同时培养时间的长短也影响阳性的检出率,大多数实验室隐球菌培养一般是5d左右发报告,但有的隐球菌培养第10天才出现阳性,故易造成漏诊。但乳胶凝集试验是对新生隐球菌荚膜多糖抗原的免疫学检测,不仅可以辅助诊断深部隐球菌病,同时可以半定量测定血清、脑脊液、支气管肺泡灌洗液和尿液中隐球菌可溶性抗原,对判断药物疗效、监测病情转归和预后有提示作用。从表1可见乳凝集试验检测25份为阳性,1份假阴性,其灵敏度达96.2%,真菌之间抗原存在着交叉反应。我们同时将173例非隐球菌病患者的血清标本分为4组:念珠菌组、细菌组、怀疑隐球菌组和正常组,与确诊的24例深部隐球菌病患者的血清、脑脊液标本同步做乳胶凝集试验。结果显示念珠菌组、怀疑隐球菌组和正常组的假阳性率均为0.0%,细菌组的假阳性率为3.2%,提示乳胶凝集试验在隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎的血清学诊断中有较高的特异度(99.4%),与报道结果相近。本研究表明,乳胶凝集试验检测新生隐球菌荚膜多糖抗原是一种简便、快速、有效诊断隐球菌感染的实验方法,在早期快速诊断中明显优于传统的培养法和镜检法,但不可避免的存在假阳性和假阴性。有文献报道,系统性红斑狼疮、结节病、类风湿因子、巨球蛋白以及毛孢子菌属、二氧化碳噬纤维菌属和抗酸杆菌均与新生隐球菌荚膜多糖抗原存在交叉抗原,引起假阳性;另一方面,操作过程中乳胶手套中的滑石粉、洗涤反应板中的清洁剂污染脑脊液标本,也可引起假阳性;而高浓度隐球菌抗原所致的钩带现象和体