细胞生物学综合实验报告

本科学生实验报告姓名学院＿生命科学学院＿专业＿班级＿10B班＿实验课程名称＿人类淋巴细胞株的培养＿指导教师及职称许琳峰＿开课时间2012至＿2013学年＿上学期云南师范大学教务处编印实验名称：人类淋巴细胞株的培养实验时间：2012.3——2012.4实验室：睿智楼3栋424小组合作：第四小组实验主要内容：1、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）2、培养基的配制3、细胞传代培养4、死活细胞的鉴别一、实验目的1、能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。2、熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法。3、熟练掌握细胞传代培养的操作方法，观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。4、掌握死活细胞的鉴别原理及方法。二、实验原理1、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）(1)、清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。(2)、体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。(3)、灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。培养基的配制细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。细胞传代培养当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定的密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比例转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。4、死活细胞的鉴别细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。原理：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。实验大体流程细胞培养准备工作培养基的配制细胞传代培养死活细胞的鉴别装置示意图实验仪器，材料及试剂工具超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器细胞培养瓶、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器（0.22μm）及注射器、离心管微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、光学显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、血球计数板、滴管、显微镜、血球计数板材料微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um、各种规格的Tip、培养细胞、人类淋巴细胞株。试剂75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、HCl、酚红、RPMI1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、NaHCO3、L-谷氨酰胺、三蒸水台盼蓝（染料）、乙醇：0.4%台盼蓝溶液六、实验步骤清洗胶塞处理塑料制品的清洗tip和tube的清洗洗液的配制消毒和灭菌化学消毒法准备（清洗与灭菌）合成培养基的配制小牛血清的处理生长培养基的配制每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基没人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖（直立放置）取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。七、实验操作方法洗液的配制常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不同的浓度成分强酸洗液次强酸洗液重铬酸钾6.3g315g12g600g浓硫酸100ml5000ml20ml1000ml蒸馏水20ml1000ml100ml5000ml配制方法：（1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。（2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。RPMI1640培养液配制1、每组称取RPMI1640干粉0.52g，溶于50ml的三蒸水。2、置于搅拌器上搅拌20min，直到液体变为澄清为止。RPMI1640合成培养基配制1、加入0.1ml1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。2、配制好的培养基，用时用饱和NaHCO3液调节pH至6.8-7.0。溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。3、瓶口封好，-20℃或4℃贮存。（四）RPMI1640生长培养基的配制50ml储备液浓度终浓度RPMI1640培养液44.5————谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清5——10%传代培养操作方法每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置死活细胞鉴别操作方法1、取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。2、取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。3、低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。4、计算：每毫升原液细胞数=4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数注：每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm31ml=1000mm3每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=1/4000mm3=1/4000,000ml实验现象及结果洗液的颜色为黑色RPMI1640培养液的配制时，置于搅拌器上搅拌20min后，液体变的澄清。RPMI1640合成培养基的配制通入二氧化碳之前为红色，通入二氧化碳之后变为金黄色。死活细胞的鉴别低倍镜下看到细胞的颜色有无色，深蓝色。计数结果如下表第一个大格第二个大格第三个大格第四个大格活细胞A45514953B64454847平均54484850死细胞A12131512B11141817平均12131614计算每毫升原液细胞数==985000个细胞存活率（%)==78%实验总结（一）、注意事项：1、洗液的配制时，向重铬酸钾中倒入浓硫酸时，速度要慢，且边到要变搅拌。2、清洗和消毒是组织培养实验的第一步，所以在清洗实验用具时，一定要反复彻底的洗干净，消毒也要做得彻底。当然灭菌手段的选择也很重要。对不同的物品需要采取不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌物品丧失了营养价值。要使细胞能够在体外长期生长，必须满足两个条件：第一、供给细胞存活所必须的条件。第二、严格控制无菌条件。培养基的配制。在此过程中涉及到的新买的小牛血清一定要灭活。细胞传代培养，在此过程中要防止可能的污染，操作一定要在超净工作台内进行，操作人员要能正确地操作超净工作台，实验开始前打开照明灯并通风，然后操作人员要点燃酒精灯，并且用酒精棉球擦手，使其消毒，之后用移液抢取样等步骤都要在酒精灯旁边完成。培养瓶盖等盖取下之后即盖上，以免被污染。死活细胞的鉴别，一定要注意滴液不要有液泡，也不能太多，否则会使盖片浮起来而使细胞计数不准。（三）实验分析与讨论1血清在细胞培养中的作用？答：血清含有一定的营养成分，含有细胞生长所必须的生长因子，酶，微量元素和激素，有保护作用，提供生长和贴附因子等，是合成培养基无法取代的，此外还能中和有毒物质的毒性。2要使细胞能在体外长期生长，必须满足哪些条件？答：（1）提供细胞存活所必须条件，如适量的水，无机盐，氨基酸，维生素，葡萄糖及有关的生长因子，氧气，适宜的温度。注意外部环境酸碱度和渗透压调节。（2）严格控制无菌条件。3配制培养基是调节PH值的目的是什么？答：是为了保证细胞在体外生存所适宜的酸碱度（三）、实验小结本次实验是通过小组的形式完成的，实验分成四次完成，由于时间有点长，导致各实验的衔接不是很好，实验过程当中也出现了很多问题，但是在实验中的每一步都严格按照要求完成。此实验的灭菌做的较好，培养基未被污染，相对不足的是PH的调试不是很精确，还有取量也不准确