化妆品中吡硫翁锌等5种去屑剂的检测方法

附件1:化妆品中吡硫翁锌等5种去屑剂的检测方法（征求意见稿）1范围本方法规定了测定发用类化妆品中水杨酸、叱硫翁锌、酮康唑、氯咪巴唑和叱罗克酮乙醇胺盐5种去屑剂的高效液相色谱法。本方法适用于发用类化妆品中水杨酸、叱硫翁锌、酮康唑、氯咪巴唑和叱罗克酮乙醇胺盐5种去屑剂的含量测定。2方法提要水杨酸、叱硫翁锌、酮康唑、氯咪巴唑和叱罗克酮乙醇胺盐5种去屑剂在230nm处有紫外吸收，以乙腈+甲醇=95+5提取化妆品中水杨酸等5种去屑剂，用高效液相色谱分离，并根据保留时间和紫外光谱图定性，峰面积定量。本方法中各种去屑剂的检出限、定量下限及取0.5g样品时的检出浓度和最低定量浓度见表1。表1各种去屑剂的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度物质名称水杨酸毗硫翁锌酮康唑氯咪巴唑毗罗克酮乙醇胺盐检出限（ng）312435定量下限（ng）1040151020检出浓度（％）0.0060.020.0080.0060.01最低定量浓度（％）0.020.080.030.020.04注：以上数据是使用二极管阵列检测器，检测波长为230nm时获取的3试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为一级实验用水。甲醇，色谱纯。乙腈，色谱纯。磷酸，相对密度=1.685,w（H3PO4）=85%,优级纯。磷酸二氢钾。乙二胺四乙酸二钠。去屑剂标准溶液：称取适量去屑剂标准品(精确至0.0001g),加85mL左右的乙腈十甲醇=95+5混合溶液，超声，待溶解完全后转移至100mL容量瓶中，用此混合溶液定容。配成如表2所示浓度的标准储备溶液，再用这种混合溶液稀释标准储备溶液配成混合标准系列。表2各去屑剂的储备溶液浓度及标准系列浓度物质名称水杨酸吡硫翁锌酮康唑氯咪巴唑吡罗克酮乙醇胺盐储备溶液浓度/(mg/L)400200400400500402040405080408080100标准系列浓度/(mg/L)160801601602003201603203204004002004004005004仪器和设备高效液相色谱仪，具有二极管阵列检测器，配色谱工作站。微量进样器或自动进样装置。pH计。超声波清洗器。离心机。分析天平，感量0.0001g。分析天平，感量0.001g。5分析步骤样品预处理称取样品约0.5g(精确至0.001g)于50mL具塞比色管中，加入乙腈+甲醇=95+5的混合溶液至刻度，振摇，超声提取30min,浑浊溶液可取适量5000rpm离心5min。经0.45m滤膜过滤，滤液作为待测样液备用。测定色谱参考条件色谱柱：C18柱，150mmx4.6mm,5^m；流动相：乙腈+甲醇+10mmol/L磷酸二氢钾水溶液[添加乙二胺四乙酸二钠至（Na2EDTA）=0.5mmol/L，用磷酸调节水溶液的pH至4.0]=50+10+40；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器，通用检测波长为230nm；水杨酸和吡罗克酮乙醇胺盐的测定可采用300nm；吡硫翁锌的测定可采用340nm。柱温：室温。校准曲线的制备在设定色谱条件下，分别取去屑剂标准系列（3.6）5^L进行高效液相色谱分析。根据标准系列质量浓度和峰面积，绘制校准曲线。样品测定在设定色谱条件下，进5|iL待测样液进行高效液相色谱分析。色谱图检出的物质，经与该物质对照品的保留时间和紫外光谱图比较确证后，根据峰面积，从校准曲线上获取相应组分的质量浓度。若待测溶液中去屑剂成分的质量浓度超过了校准曲线线性范围的上限，需对待测溶液进行适当稀释。6平行实验按以上步骤，做两份样品的平行测定。在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两次测定值的算术平均值的10%。7计算DxpxVW（去屑剂）= X10-4式中：w（去屑剂）——化妆品中去屑剂的质量分数，%；p——从校准曲线上查得的待测样液中去屑剂的质量浓度，mg/L；V——样品定容体积，mL；m——样品用量，g；D——稀释倍数（不稀释则取1）。8回收率和精密度经多家实验室验证，5种去屑剂的加标回收率在88.5%〜109.4%之间，相对标准偏差在

0.2%〜3.8%之间。9干扰排除对于有干扰的样品，测定水杨酸和吡罗克酮乙醇胺盐时建议检测波长调整为300nm,定吡硫翁锌时检测波长调整为340nm。10色谱图000图1不同检测波长下去屑剂标准色谱图1：水杨酸；2：吡硫翁锌；3：酮康唑；4：氯咪巴唑；5：吡罗克酮乙醇胺盐化妆品中吡硫翁锌等5种去屑剂的检测方法起草说明为进一步完善化妆品中禁限用物质检测方法标准体系，加强化妆品中禁限用物质的监督管理，国家食品药品监督管理局于2011年6月委托中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所开展化妆品中去屑剂砒硫翁锌检测方法建立和验证工作，现就起草工作有关情况说明如下：1起草的必要性中国健康教育协会头皮健康研究中心的数据显示：中国60%以上成年人的头皮都不同程度地存在健康问题！选择去屑香波是人们解决这一问题广泛使用的方法。市场调研表明，水杨酸、叱硫翁锌（简称ZPT）、叱罗克酮乙醇胺盐（商品名Octopirox）、氯米巴唑（商品名甘宝素）和酮康唑是市场上去屑香波及其他去屑产品的主要去屑剂，其中叱硫翁锌是使用频率最高的去屑剂。《化妆品卫生规范》（2007年版）规定作为去屑剂使用时，化妆品中水杨酸的最大允许浓度为2%（驻留类产品）和3%（淋洗类产品）；叱硫翁锌为1.5%；叱罗克酮乙醇胺盐为0.5%（驻留类产品）和1%（淋洗类产品）；氯米巴唑为0.5%；而酮康唑为禁用成分。《化妆品卫生规范》（2007年版）已收录了水杨酸、叱罗克酮乙醇胺盐、氯咪巴唑和酮康唑4种去屑剂的检测方法，但尚无ZPT的检测方法。因此在现有的《化妆品卫生规范》（2007年版）去屑剂检测方法的基础上，建立化妆品中叱硫翁锌去屑剂的检测方法，对维护消费者的健康和权益具有重要意义。2起草依据及文献（1）《化妆品卫生规范》（2007年版）（2）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范（3）肖子英，中国香波市场，日用化学品科学，2001,24（2）：11〜13.（4）李彤，洗发类化妆品的刺激性研究，环境与健康杂志，2001,18（6）：364〜366.（5）王萍，李洁，张晓鸣，反相高效液相色谱法测定香波中一种新型去屑止痒剂的含量，中华预防医学杂志，2003,37（3）：196〜198.（6）邬宁昆，罗云杰，甘宝素气相色谱分析，宁波高等专科学校校报，2000,12（14）：24〜26.（7）刘超，何学民，反相高效液相色谱法测定去屑香波中去屑止痒剂Octopirox的含量，日用化学工业，2001,2（1）：47〜48.（8）ChaoL.,Simultaneousdeterminationoffouranti-dandruffagentsincludingoctopiroxinshampooproductsbyreversed-phaseliquidchromatography,InternationalJournalofCosmeticScience,2001,23：183〜188.3起草原则本检测方法兼具先进性和可行性，在现有去屑剂检测方法的基础上增加了使用频率最高的吡硫翁锌，使方法的实用性更强，且方法编写条理清晰，可操作性强，尽量采用目前化妆品检测实验室普遍具备的分析技术，并选择准确、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的准确性和重现性。4起草过程国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司（以下称保化司）于2011年6月委托中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所开展化妆品中去屑剂砒硫翁锌检测方法的建立和验证工作。我们通过查阅国内外相关文献资料，并在原有实验数据的基础上，重点考察了现有的《化妆品卫生规范》（2007年版）中4种去屑剂的检测方法和新增加的吡硫翁锌检测方法的兼容性。同时，鉴于吡硫翁锌在大多数溶剂中溶解性较差，考察了多种可行的有机溶剂，最终选择了适宜的溶剂，并根据吡硫翁锌在该溶剂中的溶解度，确定了标准溶液的配制方法及方法的线性范围。在干扰试验方面，通过紫外光谱图初筛和选择多个检测波长的方式，有效避免了可能存在的干扰。通过大量的样品检测和征求多家检验机构、化妆品企业的意见，最终形成了《化妆品中吡硫翁锌等5种去屑剂的检测方法》研究报告。2012年1月9日，保化司组织召开专家论证会，认为该方法基本满足现阶段化妆品中上述物质的检测要求，并提出了相关修改意见。根据专家论证会意见，项目承担单位对检测方法进行了修改完善，并经2012年2月29日保化司司务会讨论通过后形成此征求意见稿。5重点说明的问题（1）关于体例。本检测方法的体例主要参照《化妆品卫生规范》（2007年版）的卫生化学检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。（2）关于检测方法的建立和验证。《化妆品卫生规范》（2007年版）已收录了水杨酸、吡罗克酮乙醇胺盐、氯咪巴唑和酮康唑4种去屑剂的检测方法，但尚无吡硫翁锌的检测方法。通过调整实验条件，建立了同时测定水杨酸、吡硫翁锌、吡罗克酮乙醇胺盐、氯咪巴唑和酮康唑5种去屑剂的检测方法。本项目中5种去屑剂的方法检出限小于12ng，高、中、低不同浓度的加标回收率在88.5%〜109.4%之间，相对标准偏差在0.2%〜3.8%之间，在20mg/L〜500mg/L的浓度范围内（吡硫翁锌因溶解性问题只做到200mg/L）线性关系良好（》0.998）,满足分析检测要求。三家实验室验证结果表明，校准曲线、检出限、精密度、回收率等指标符合检测要求。（3）关于吡硫翁锌的溶解性。吡硫翁锌在乙腈中的溶解性有限，因此建议最高浓度混合标准溶液中吡硫翁锌的浓度不应超过200mg/L,同时为确保吡硫翁锌的溶解，在配制过程中必须用大量的流动相先溶解，再定容。（4）干扰试验。230nm为5种去屑剂的通用检测波长，但很多有机物在此检测波长下有吸收，为此对于吡硫翁锌、水杨酸和吡罗克酮乙醇胺盐可以增加第二个检测波长（分别是340nm、300nm和300nm）,以提高方法的抗干扰能力。化妆品中吡硫翁锌等5种去屑剂的检测方法编制说明1任务来源受国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司委托，根据食药监许函［2011］260号《关于委托开展化妆品中去屑剂叱硫翁锌检测方法研究的函》，开展化妆品中叱硫翁锌等5种去屑剂检测方法研究，建立发用类化妆品中多种去屑剂的快速、准确、灵敏的色谱检测方法。2研究背景中国健康教育协会头皮健康研究中心的数据显示：中国60%以上成年人的头皮都不同程度地存在健康问题！选择去屑香波是人们解决这一问题广泛使用的方法。据文献报道，目前去屑香波已占洗发水总量的35%以上［1］。去屑剂的种类和含量不仅决定去屑效果优劣，而且对消费者的健康也有一定的影响。研究表明，对比于普通香波，止痒型去屑香波的急性眼刺激实验为轻度刺激，多次皮肤刺激实验显示止痒型去屑香波可使皮肤增厚，变硬2］。市场调研表明，水杨酸、叱硫翁锌（简称ZPT）、叱罗克酮乙醇胺盐（商品名Octopirox）、氯米巴唑（商品名甘宝素）和酮康唑是市场上去屑香波及其他去屑产品的主要去屑剂，其中叱硫翁锌是使用频率最高的去屑剂。《化妆品卫生规范》（2007年版）规定作为去屑剂使用时，化妆品中水杨酸的最大允许浓度为2%（驻留类产品）和3%（淋洗类产品）;叱硫翁锌为1.5%；叱罗克酮乙醇胺盐为0.5%（驻留类产品）和1%（淋洗类产品）；氯米巴唑为0.5%；而酮康唑为禁用成分。因此建立化妆品中去屑剂的检测方法，对维护消费者的健康和权益具有重要意义。3研究现状目前对上述几种去屑剂的测定主要采用高效液相色谱法（HPLC）。如美国药典2003版本规定了用HPLC来测定水杨酸及酮康唑；王萍等采用反相高效液相色谱法测定了去屑香波中的甘宝素［3］；邬宁昆等采用气相色谱法测定了去屑香波中的甘宝素4］；刘超、何学民采用反相高效液相色谱法测定去屑香波中Octopirox的含量［5］；上海家化联合股份有限公司采用高效液相色谱法测定了去屑香波中的水杨酸、酮康唑、甘宝素和Octopirox的含量［6］。《化妆品卫生规范》（2007年版）也已收录了水杨酸、叱罗克酮乙醇胺盐、氯咪巴唑和酮康唑4种去屑剂的检测方法，但尚无ZPT的检测方法。本课题拟在现有的《化妆品卫生规范》（2007年版）去屑剂检测方法的基础上，通过调整实验条件，建立同时测定水杨酸、吡硫翁锌、吡罗克酮乙醇胺盐、氯咪巴唑和酮康唑5种去屑剂的检测方法。4项目完成情况根据食药监许函[2011]260号《关于委托开展化妆品中去屑剂吡硫翁锌检测方法研究的函》，并考虑方法的实用性，在现有的《化妆品卫生规范》（2007年版）去屑剂检测方法的基础上，通过调整实验条件，建立了同时测定水杨酸、吡硫翁锌、吡罗克酮乙醇胺盐、氯咪巴唑和酮康唑5种去屑剂的检测方法。具体情况如下：（1）建立了发用类化妆品中5种去屑剂的高效液相色谱检测方法。本项目中5种去屑剂的方法检出限小于12ng，高、中、低不同浓度的加标提取回收率在88.5%〜109.4%之间，相对标准偏差在0.2%〜3.8%之间，在20mg/L〜500mg/L的浓度范围内（吡硫翁锌因溶解性问题只做到200mg/L）线性关系良好（》0.998）,满足分析检测要求。（2）本方法负责起草单位为中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，参与验证单位分别是上海家化联合股份有限公司、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心。本方法主要起草人为朱英、杨艳伟、宋钰、张卫强，参加起草人为刘超、谢剑锋、吴黎昌、张泓、徐伟东、杜达安。宝洁（中国）有限公司在方法的研究过程中提出了很多宝贵的建议。验证结果满足《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》相关要求。5方法概述仪器Agilent公司Agilent1100高效液相色谱仪，超声波清洗器。试齐IJ水杨酸（分析纯），吡硫翁锌（对照品，纯度为6%,宏开永盛精细化工有限公司），酮康唑（对照品，纯度三98%,北京贝丽来日用化工厂），氯咪巴唑（标准品，百灵威化学公司），吡罗克酮乙醇胺盐（对照品，纯度为8%,宏开永盛精细化工有限公司）。乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），磷酸（优级纯），磷酸二氢钾（分析纯），乙二胺四乙酸二钠（分析纯）。5.3方法色谱条件色谱柱：ZORBAXC18柱，150mmx4.6mmI.D.,5|im；流动相：乙月青+甲醇+水溶液(10mmol/L磷酸二氢钾和0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，磷酸调pH=4.0)=50+10+40；检测器：二极管阵列检测器，检测波长230nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃。校准曲线的制备混合标准溶液配制：称取适量水杨酸、吡硫翁锌、酮康唑、氯咪巴唑和吡罗克酮乙醇胺盐5种去屑剂标准品，加乙腈+甲醇=95+5溶液85mL左右，超声，待溶解完全后转移至100mL容量瓶中，用乙腈+甲醇=95+5定容。配成各组分质量浓度分别为400mg/L、200mg/L、400mg/L、400mg/L、500mg/L的混合标准储备溶液。准确吸取混合标准储备溶液1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL、10.0mL于10mL具塞刻度管中，用乙月青+甲醇=95+5稀释至刻度，摇匀。此标准系列中各组分的质量浓度见表1。表1去屑剂的储备溶液浓度及标准系列浓度物质名称水杨酸吡硫翁锌酮康唑氯咪巴唑吡罗克酮乙醇胺盐储备溶液浓度/(mg/L)400200400400500402040405080408080100标准系列浓度/(mg/L)16080160160200320160320320400400200400400500校准曲线的绘制：在设定色谱条件下，分别取5|iL进行HPLC分析，并根据标准系列质量浓度和峰面积绘制校准曲线。图1为不同检测波长下5种去屑剂标准的色谱图。000图1不同检测波长下去屑剂标准色谱图1：水杨酸；2：吡硫翁锌；3：酮康唑；4：氯咪巴唑；5：吡罗克酮乙醇胺盐样品预处理称取样品约0.5g（精确至0.001g）于50mL具塞刻度管中，加入乙腈+甲醇=95+5至刻度，振摇，超声提取30min,必要时可高速离心。经0.45m滤膜过滤，滤液作为待测样液备用。在设定色谱条件下，取5〃L待测样液进行HPLC分析。计算根据峰面积，于校准曲线得出去屑剂各组分的质量浓度，样品中去屑剂的最终浓度应在此浓度上乘稀释倍数。6方法研究吡硫翁锌的溶解性吡硫翁锌不溶于水，在其它许多常用溶剂中的溶解性亦较差，选择多种溶剂进行实验，结果表明在乙腈、氯仿等溶剂中有一定的溶解性，在二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺溶剂中溶解度较大。二甲基亚砜极性很强，在高效液相色谱法中对色谱柱有损坏。若采用N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺做溶剂，在高效液相色谱测定过程中，产生很大的色谱峰，干扰分离测定。同时考虑其它4种组分的溶解性，选择乙腈溶解吡硫翁锌标准品。吡硫翁锌在乙腈中部分溶解，因此也限制了其测定的线性范围。流动相考察了甲醇十乙腈、乙腈+水溶液（10mmol/L磷酸二氢钾和0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，磷酸调pH=4.0）、乙腈+甲醇+水溶液（10mmol/L磷酸二氢钾和0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，磷酸调pH=4.0）等多种流动相中5种去屑剂的分离情况。结果表明，采用甲醇+乙腈为流动相时，只有3种去屑剂出峰。选择乙腈+水溶液（10mmol/L磷酸二氢钾和0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，磷酸调pH=4.0）为流动相时，其体积比不同，5种去屑剂的分离情况有很大差异。乙腈+水溶液（10mmol/L磷酸二氢钾和0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，磷酸调pH=4.0）体积比为75+25时，在20min内水杨酸、氯米巴唑、吡罗克酮乙醇胺盐3种成分出峰，酮康唑、吡硫翁锌未出峰；体积比为50+50时，20min内水杨酸、酮康唑、氯米巴唑3种成分出峰，吡硫翁锌和吡罗克酮乙醇胺盐未出峰；体积比为40+60时，20min内水杨酸、吡硫翁锌、酮康唑3种成分出峰，氯米巴唑、吡罗克酮乙醇胺盐未出峰。当体积比为60+40时，10min内5种物质均出峰，但分离不完全。这主要是因为乙腈极性较大，几种组分共同出峰。因此，在流动相中加入一定比例的甲醇，减小流动相的极性，从而实现了5种去屑剂完全分离。实验表明，流动相为乙腈+甲醇+水溶液（10mmol/L磷酸二氢钾和0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，磷酸调pH=4.0）=50+10+40时，5种去屑剂可完全分离。检测波长不同的化合物有不同的特征吸收波长，图2列出了5种去屑剂的自外吸收光谱图。为同时测定5种去屑剂，综合考虑选择230nm为通用检测波长。对于有干扰的样品，测定水杨酸和吡罗克酮乙醇胺盐时建议检测波长调整为300nm，测定吡硫翁锌时检测波长调整为340nm。

图25种去屑剂的光谱图线性范围及检出限在设定色谱条件下，测定不同浓度的混合标准溶液6次，其浓度与峰面积相关。检出限以噪音的3倍计算。5种去屑剂成分在230nm处的回归方程、相关系数、线性范围及方法检出限见表2。表2去屑剂的回归方程、相关系数、线性范围及方法检出限物质名称回归方程相关系数r线性范围/(mg/L)检出限/ng水杨酸C=0.0720A+1.730.998740〜4001吡硫翁锌C=0.1242A+15.10.998620〜2001酮康唑C=0.1033A+1.520.999740〜4002氯米巴唑 C=0.1335A+0.20 0.9997 40〜400 2吡罗克酮乙醇胺盐 C=0.2464A+16.7 0.9993 50〜500 5精密度对不同品牌的化妆品样品重复测定6次，水杨酸、吡硫翁锌、酮康唑、氯米巴唑、吡罗克酮乙醇胺盐5种去屑剂的相对标准偏差分别为1.2%、2.4%、0.7%、0.9%、3.8%，结果见表3。表3去屑剂的精密度试验结果物质名称测定值/%均值/%相对标准偏差/%水杨酸1.9471.9581.9391.9131.9111.9001.9281.2吡硫翁锌0.9891.0350.9871.0471.0291.0191.0182.4酮康唑2.0782.0402.0692.0502.0612.0742.0620.7氯米巴唑0.2940.3010.2960.2950.2970.2950.2960.9吡罗克酮乙醇胺盐0.2360.2630.2540.2480.2560.2570.2523.86.6准确度测定7种添加不同去屑剂的化妆品样品的加标回收率，各组分的加标回收率分别为水杨酸在97.8%〜105.6%之间；吡硫翁锌在92.7%〜104.9%之间；酮康唑在96.0%〜102.1%之间；氯米巴唑在98.7%〜103.5%之间；吡罗克酮乙醇胺盐在98.4%〜103.1%之间。样品测定利用本法，对于超市和药店销售的18种去屑香波和药品进行测定，有14种样品含有5种去屑剂中的一种或几种，检出率为78%,图2为典型样品色谱图。其中2种样品含水杨酸，占11%；4种样品含吡硫翁锌，占22%；3种样品含酮康唑（去屑药品），占17%；5种样品含氯米巴唑，占28%；1种样品含吡罗克酮乙醇胺盐，占6%。高效液相色谱法同时测定去屑香波中的5种去屑剂，样品前处理操作简便、回收率高、色谱峰重现性好