化妆品检测-全

#如产酸产气，则划线接种到伊红美兰琼脂平板上，在37°C培养(18〜24)h,同时取该培养液(1〜2)滴接种到蛋白胨水中，在44C培养24ho经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长，大肠菌群在伊红美兰琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为大肠菌群，均应注意挑选。挑选上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检。在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL,观察靛基质反应，阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。5．检验结果平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阳性短杆菌，靛基质试剂验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。绿脓杆菌的检验方法绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。它对人体致病，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症。因此，在化妆品标准中规定不得检出绿脓杆菌。1．检验原理其检查方法是根据绿脓杆菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外，还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42C下生长等。可与类似菌相区别。2．仪器培养箱、三角烧瓶、试管、灭菌平皿、灭菌刻度吸管、显微镜、载玻片、接种针或接种环、电炉、高压消毒锅。3．培养基和试剂SCDLP液体培养基制备方法与前述SCDLP液体培养基制备一致。十六烷基三甲基溴化铵培养基：配方见表8-27所示。物质用量物质用量物质用量物质用量牛肉膏3g十六烷三甲基溴化铵0.3g蛋白胨10g琼脂20gNaCl5g蒸馏水1000mL制备方法：除琼脂外，将上述物质混合加热溶解，调pH为7.4〜7.6，加入琼脂，在69kPa压力下灭菌20min后，制成平板，备用。。乙酰胺培养基：配方见表8-28所示。°表8-28乙酰胺培养基配方物质用量物质用量乙酰胺10.0gNaCl15.0gk2hpo41.39g酚红0.012gkh2po40.73gMgSO4・7H2O0.5g琼脂20g蒸馏水1000g制备方法：除琼脂和酚红外，将其它成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，在0.1MPa压力下高压灭菌20min后，制成平板，备用。（4）绿脓菌色素测定用培养基：配方见表8-29所示。表8-29绿脓菌色素测定用培养基配方物质用量物质用量蛋白胨20g琼脂18gMgCl21.4g甘油（化学纯）10gK2SO410g蒸馏水1000mL制备方法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使之溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，在69kPa压力下高压灭菌20min后，制成斜面，备用。（5）明胶培养基：配方见表8-30所示。表8-30明胶培养基配方物质用量物质用量牛肉膏3g蛋白胨5g明胶120g蒸馏水1000mL制备方法：取各成分加在蒸馏水中浸泡20min,随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4,分装于试管内，经在69kPa压力下灭菌20min后，直立制成高层，备用。（6）硝酸盐蛋白胨水培养基：配方见表8-31所示。表8-31硝酸盐蛋白胨水培养基配方物质用量物质用量蛋白胨酵母浸膏蒸馏水10g3g1000g亚硝酸钠硝酸钾0.5g2g制备方法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH值为7.2。煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，在）9kPa压力下灭菌20min后，备用。（7）普通琼脂斜面培养基：配方见表8-32所示。表8-32普通琼脂斜面培养基配方物质用量物质用量蛋白胨10gNaCl5g琼脂15g蒸馏水1000mL牛肉膏3g制备方法：除琼脂外，其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2〜7.4,加入琼脂，加热溶解，分装试管，在0.1MPa压力下高压灭菌15min后，制成斜面,备用。4．检验步骤（1）增菌培养：取1：10样品稀释液10mL加到90mLSCDLP液体培养基中，置42°C培养箱中，培养（18〜24）h,如有绿脓杆菌生长，培养液面会有一层薄菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。检验含防腐剂的化妆品时,在每1000mL普通肉汤中加1g卵磷脂，7g吐温80。（2）分离培养：从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上。置37C培养（18〜24）h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落为扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延。表面湿润，菌落呈灰白色。菌落周围培养基常有水溶性色素扩散。此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。也可以用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放37°C培养24h,绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它菌不生长。（3）染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阳性者进行氧化酶试验。（4）氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的10g/L二甲基对苯二胺试液，在（15〜30）s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，氧化酶试验阴性。（5）绿脓菌素试验：取可疑菌落（2〜3）个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，37C培养24h，加入氯仿（3〜5）mL，充分振荡，使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中，并加入lmol/L的盐酸lmL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。（6）硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐胨水中，于37C培养24h,观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸分解产生氮气。（7）明胶液化试验：取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基中，于37C培养24h,取出放入冰箱（10〜30）min，如仍是溶解状即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。（8）42C生长试验：提取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在（41〜42）C培养箱中，培养（34〜48）h,绿脓杆菌能生长，为阳性。近似的荧光假单胞菌则不能生长。（9）检验结果报告：被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶，硝酸盐还原产气和42C生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄菌有重要意义。1．检验原理美国CTFA和FDA检验化妆品中的金黄色葡萄球菌时，不经增菌直接接种到Vogel-Johnoson琼脂培养基上；日本方法则先用SCDLP或SCD液体培养基增菌后，再接种Vogel-Johnoson琼脂培养基。经试验证明增菌后检出效果好。故我国采用先增再分离方法。分离金黄色葡萄球菌的培养基很多，如Vogel-Johnoson琼脂、Baird-Parker琼脂、血琼脂、卵黄高盐琼脂、TMP琼脂等。考虑到国内的习惯应用，可采用Baird-Parker琼脂或血琼脂。下一步的检验各国都相同。根据本菌特有的形态及培养特性，用Baird-Parker平板进行分离，该平板中的氯化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率，并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征来鉴别。2．培养基和试剂（1）SCDLP液体培养基制备方法与前述SCDLP液体培养基制备一致。2)7.5%氯化钠肉汤培养基：配方见表8-33所示。表8-337.5%氯化钠肉汤培养基配方成分组成成分组成蛋白胨10g氯化钠75%牛肉膏3%蒸馏水1000mL制备方法：将上述成分加热溶解，调pH为7.4,分装，121°C,1.5min高压灭菌(3)Baird-Parker平板：配方见表8-34所示。表8-34Baird-Parker平板配方成分组成成分组成胰蛋白胨10g氯化锂(LiCl・6H2O)5g牛肉膏5g琼脂20g酵母浸膏1g蒸馏水(pH7.0±0.2)950mL甘氨酸12g增菌剂的配制：30%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于冰箱内。Baird-Parker平板制备方法：将各成分中到蒸馏水中，加热煮佛完全溶解，冷至25C校正pH。分装每瓶95mL高压灭菌15min。临用时热溶化琼脂，每95mL加入预热至50C的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL,摇匀后倾注于平板。培养基应的致密不透明的。使用前在冰箱贮存不得超过48h。血琼脂培养基：配方见表8-35所示。表8-35血琼脂培养基配方成分组成成分组成营养琼脂100mL脱纤维羊血(兔血)10mL制备方法：将营养琼脂加热溶化，待冷至50C左右以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀,制成平板，置冰箱内备用。甘露醇发酵培养基：配方见表8-36所示。表8-36血琼脂培养基配方成分组成成分组成蛋白胨10g牛肉膏5g氯化钠5g0.2%溴香草酚蓝溶液10mL甘露醇10g蒸馏水1000mL制备方法：将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调pH至7.4，加入甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，115C灭菌20min，备用。兔(人)血浆制备取3.8柠檬钠溶液(121C灭菌30min)1份加兔(人)全血4分，混匀静置，(2000〜3000)r/min离心(3〜5)min。血球下沉，取上面血浆。3．仪器显微镜、培养箱、离心机、灭菌试管、载玻片。灭菌吸管：1mL，5mL，10mL4．测定步骤(1)增菌取1：10稀释的的样品10mL接种到90mLSCDLP液体培养基中(如无此培养基也可用7.5%氯化钠肉汤培养基)，置37°C培养箱，培养24ho注：如无此培养基地也可用7.5%氯化钠肉汤培养基，检验含防腐剂的化妆品时，可在1000mL此培养基中加1g卵磷脂，7g吐80o(2)分离自上述增菌培养液中，取(1〜2)接种环，划线接种在Baird-Parker氏培养基，如无此培养基地也可划线接种到血琼脂平板，置37C培养(24〜48)ho在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker氏培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为(2〜3)mm,颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置37C培养24ho染色镜检挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽抱，无夹膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为(0.5〜1)例。甘露醇发酵试验取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，置37C培养24ho,金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验玻片法：到清洁干燥载玻片，一端滴加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取待检菌落，分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性，主玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验。试管法：吸取1：4的新鲜血浆0.5mL。混匀，放37C温箱或水浴中，每半小时观察一次，24h之内如于现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL,分别加入灭菌小试管内0.5mL1:4的血浆混匀，做为对照。5．检验结果凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。8.5.5霉菌和酵母菌的检验1、检验原理霉菌和酵母菌数测定(Determinationofmoldsandyeastcount)是指化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1ml化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，籍以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28C±2C培养72h，计算所生长的霉菌和酵母菌数。2、仪器和设备培养箱：28C±2C；振荡器；天平；三角瓶：250m1；试管：15X150mm；平皿:直径9cm；吸管：1ml、10ml；量筒：200ml；酒精灯；高压灭菌器3、培养基和试剂°C1）生理盐水与细菌总数测定用的生理盐水一致。2）虎红（孟加拉红）培养基表37虎红培养基成分用量成分用量蛋白脓5g涼脂20g葡萄糖10g1/3000虎红溶液（四氯四碘荧光素）100ml磷酸二氢钾1g氯霉素100mg硫酸镁（含7H2O）0.5g蒸馏水1000ml制法：将上述各成分（除虎红外）加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液分装后，103.43kpa（121Q51b）20min高压灭菌，另用少量乙醇溶解氯霉素，过滤溶解后加入培养基中，若无氯霉素，使用时每1000ml加链霉素30mg4、操作步骤1）样品稀释与细菌菌落总数测定稀释方法一致。2）培养取1：10、1：100、1：1000的检液各1ml分别注入灭菌平皿内，每个稀释各