发育与生殖重要哺乳动物模型的建立

项目名称：发育与生殖重要哺乳动物模型的建立首席科学家：赖良学中国科学院广州生物医药与健康研究院起止年限：2011.1至2015.8依托部门：中国科学院二、预期目标总体目标：通过进化基因组学、比较基因组学等方法，规模化创造和挖掘猪的基因资源；了解小型猪发育、生理、生殖的基本规律，阐明小型猪早期胚胎基因表达调控机理；完善小型猪遗传修饰的相关技术平台，推动小型猪模型的研究，获得一批在生殖和发育研究领域具有重要应用价值的小型猪模型；取得拥有自主知识产权的新发现、新技术和新方法，建立小型猪模型研究的国际一流基地；造就一支具有国际竞争力的，由优秀中青年科学家组成的创新团队，培养一批能独立从事高水平科学研究的后备力量，加快医用小型猪在生物医学和基础研究中的应用，为发育和生殖研究提供理想的动物模型，最终确立我国在这一极富竞争性的前沿探索领域的领先地位。五年预期目标：建立猪的基因组学研究技术方案，利用猪的基因组学等分子生物学手段充分挖掘猪的基因资源，获得较为完善的小型猪基因组学数据库；建立完善的小型猪发育、生理、生殖等相关数据库；新发现3-5个在早期胚胎发育中表现有显著差异的关键基因，阐明新发现的关键基因在早期胚胎分化过程中对靶基因转录的调控作用；筛选并验证3-5个在小型猪早期胚胎发育过程中起关键作用的miRNA，并阐明其调控机制。解析早期胚胎分化关键基因的调控网络。利用体细胞核移植技术与基因组修饰技术建立5-8种生殖发育相关猪模型；培养研究生40名，造就一支具有国际竞争力的，由优秀中青年科学家组成的创新团队，培养一批能独立从事高水平科学研究的后备力量；在本领域的国际代表性学术SCI刊物上发表40余篇学术论文，其中影响因子高于5的不少于12篇。培养一批从事猪模型研究的交叉学科人才。10．主办一次小型猪模型研究的国际性学术研讨会。三、研究方案课题设置的思路及课题间的关系：本项目以中国科学院广州生物医药与健康研究院为主体，联合深圳华大基因研究院、华南农业大学、昆明医学院、吉林大学和云南农业大学等单位，围绕总体研究目标，本项目设立4个课题组，研究过程中相互配合、优势互补，提倡资源共享。本项目的执行采用首席科学家负责制。首席科学家将充分发挥课题负责人和学术带头人的作用，采用学科交叉、分工合作的方式来实施研究计划。同时，首席科学家将在相关部门的领导下，根据国家规定，通过项目专家委员会，采用激励和滚动机制对项目进行管理。本项目课题设置上紧密围绕生殖发育研究用小型猪模型建立这一重大科学问题，在研究小型猪基因组学、发育生殖基因表达调控机理研究的基础上最终通过体细胞核移植技术获得一系列在生殖和发育研究中具有应用价值的转基因猪模型。围绕这一主线，本项目在已有相关研究工作的基础上，设置各有特点，互相紧密联系，且互相促进的四个课题，即1).小型猪基因组学研究；2).小型猪生殖发育相关数据库建立及早期胚胎基因表达调控研究；3).生殖相关小型猪模型的建立；4).发育相关小型猪模型的建立。其中课题一和课题二的研究为小型猪作为动物模型提供最为基础的、必不可少的基因组数据和基因表达调控数据，为建立模型提供基础的数据支持；后两个课题分别以生殖和发育模型的建立为主要目标分工进行，但在模型制作的技术上又相互紧密联系、互相促进。本项目课题设置上保证了各个课题有机地结合，各方面的研究工作既具有明确的研究目标，同时又相互紧密联系，形成我国在这一前沿领域的研究特色。本项目期望在生殖发育重要哺乳动物模型建立的关键科学问题上取得重大突破性成果，保证按期完成项目的总体目标和五年目标课题间关系概述如下图。课题间关系：小型猪模型生殖发育相关数据库的建课题三：生殖相关小型猪模型的建

立小型猪模型生殖发育相关数据库的建课题三：生殖相关小型猪模型的建

立课题四：发育相关小型猪模型的建

立课题一：小型猪基因组学研究课题二课题一：小型猪基因组学研究小型猪早小型猪早期胚胎发期胚胎发育基因表育基因表达谱研究达调控研提供基础数据建立动物模型1r1r1r1『1T理卩1『条件性缺失抑Oct4-生殖细成熟运动ISL1+WT1-E去除生制素aGFP胞组织BDNF神经心脏GFP肾殖细胞亚基的转基特异性及其前元发刖体脏、生小型猪高繁殖因克表达体转基育研细胞殖腺发模型的力小型隆猪CRE猪因小型究小发育育小型建立猪模型模型模型的猪模型型猪小型猪模型的建立的制备制备的建立模型建立猪型.\立模建建立课题设置及每个课题的主要研究内容、技术路线：课题一：小型猪基因组学研究承担单位：深圳华大基研究院；课题负责人：李松岗；课题经费比例：16%主要参加人员：李松岗、杜玉涛、张承担单位：深圳华大基研究院；课题负责人：李松岗；课题经费比例：16%主要参加人员：李松岗、杜玉涛、张本课题拟选择我国特有的两种高度近交医用小型猪资源：版纳小型猪和五指山小型猪作为动物模型，利用基因组学等分子生物学手段充分挖掘医用小型猪的基因资源。利用高通量、快速测序技术和系统的生物信息学分析方法完成小型猪全基因组测序工作，构建小型猪基因组学数据库。为小型猪作为动物模型提供最为基础的、必不可少的基因组数据，为建立模型提供基础的数据支持。以人类和家猪的基因组为参照，运用比较基因组学方法对小型猪进行全基因组解读，进行跨物种基因注释，找出与人类疾病相关基因在小型猪里的直系同源基因，为建立小型猪疾病模型建立提供数据基础。技术路线：全基因组鸟枪法测序对小型猪基因组进行功能注释及杂合区域检测V收集整理注释小型猪生殖与发育相关数据Ir建立完整的小型猪生殖发育基因数据库课题二：小型猪生殖发育相关数据库建立及早期胚胎基因表达调控研究承担单位：华南农业大学；参加单位：云南农业大学；课题负责人：张守全；课题经费比例：23%；主要参加人员：张永亮、吴珍芳、魏红江建立两种小型猪以及课题3，4建立的小型猪模型的生殖生理及发育相关数据库，为小型猪动物模型研究和应用提供基础的数据支持；建立小型猪早期胚胎发育分化的基因表达谱；确定新发现的关键基因在早期胚胎分化过程中的时空表达谱，并阐明其对靶基因转录的调控作用；阐明5种以上关键基因及MiRNA对小型猪早期胚胎发育分化过程中的调控机制。检测两种小型猪以及课题3，4建立的各种小型猪模型的生殖生理及发育相关数据，建立数据库。包括：小型猪基础生物学指标研究及数据库的建立：生殖生理、生化数据采集及其数据库的建立；正常组织学背景数据库建立。.小型猪早期胚胎发育调控相关候选基因的确定与相应抗体和探针的获得根据小鼠以及人的早期胚胎分化调控基因研究文献选定20个左右候选基因作为本次研究对象。筛选的原则为：对早期胚胎分化具有重要的调控作用；在小鼠和人早期胚胎发育中的研究较为系统；猪基因组中相关基因的信息较为明确(允许个别重要候选基因在猪基因组中无相关信息，这样就需要在本研究中系统开展该基因的工作)。如果小鼠或人的相关基因产物的抗体在猪胚胎研究中可用则直接借用，如基于小鼠或人的抗体效果不佳，则将通过钓取小型猪的基因，体外原核表达蛋白后自制相应单克隆抗体；原为杂交的探针将根据猪基因组信息合成。.小型猪早期胚胎发育模式及胚胎发育调控关键基因筛选小型猪发情配种当日定位第0天，实验将收集第1天至第20天的体内胚胎，间隔1天取样，每个阶段至少收集2头个体的胚胎；所获得的胚胎1/3用于发育模式研究，1/3用于候选基因表达产物的免疫组化研究，1/3用于候选基因的原位杂交研究；候选基因根据发育模式、免疫组化以及原为杂交结果的比对分析最终确认分化关键基因。.小型猪早期胚胎发育调控关键基因功能研究小型猪早期发育关键基因筛选出后，根据相应基因的信息构建过表达载体以及整合型RNAi载体，转染小型猪胎儿成纤维细胞，通过核移植构建上述基因过表达与扰低的胚胎，跟踪胚胎的发育模式，并分析相关基因的表达状况，探索这些基因在早期胚胎发育中的作用。.早期胚胎发育调控关键基因的表观遗传调控根据小型猪早期胚胎分化基因时空表达谱的信息，收集相应阶段的小型猪胚胎，提取总RNA和DNA，通过real-timePCR、亚硫酸盐测序和ChIP技术测定关键基因的表观遗传调控及其与基因表达的关系。.小型猪与其它品种猪早期胚胎发育调控关键基因表达与调控机制比较在初步探明小型猪早期胚胎发育调控关键基因及其调控模式后，选取具有代表性的关键基因以及基因发挥调控功能的关键阶段来收集其它品种的猪胚胎，采用上述方案研究相应基因的表达、功能及调控机制，最终与小型猪相应研究结果比较获得小型猪与其它品种猪早期胚胎发育模式及调控机制的差异资料。课题三：生殖相关小型猪模型的建立承担单位：中国科学院广州生物医药与健康研究院；参加单位：吉林大学；华南农业大学；课题负责人：赖良学；课题经费比例：31%；主要参加人员：周虚、郭新政、张明军、刘朝明本课题的主要目标是建立生殖发育研究中具有重要应用价值的生殖相关小型猪模型，围绕这一目标，我们选择五指山和云南版纳近交系小型猪这一目前公认的最为理想的人类疾病和生殖发育研究模型作为研究对象，在课题1和课题2对其最为基本的基因组学和常规生理生化数据进行搜集整理的基础上，结合我们已有的研究基础，我们将采用转基因克隆技术这一目前最为先进的转基因猪制作技术进行一系列生殖相关小型猪模型的建立。1）.条件性去除生殖细胞小型猪模型的建立Tet-On诱导特异性去除生殖细胞小型猪模型的制备选择雄性生殖细胞特异表达基因（如Mvh）的启动子，构建Tet-On系统的调控部分，制备转基因小型猪M-Regulator。选择雌性生殖细胞特异表达基因（如Zp3）的启动子，构建Tet-On系统的调控部分，制备转基因小型猪F-Regulator。在Tet-On系统的效应部分，插入白喉毒素A（diphtheriatoxinA，DTA）的表达序列，制备转基因小型猪DTA-Responder。M-Regulator、F-Regulator和DTA-Responder小型猪交配产生的转三基因小型猪“DTAOn-GermOut”，该猪在药物Dox的诱导下可以剂量依赖性地破坏雄性或者雌性小型猪的生殖细胞。2.“DTAOn-GermOut”小型猪模型的检测和利用研究该模型在Dox诱导后，雄性和雌性生殖细胞（精子和卵子）的存活状态、生殖器官（睾丸和卵巢）的生理状态、以及动物个体的发育状况。以该模型小型猪的囊胚作为制备嵌合体的受体胚胎，在嵌合体小型猪成长过程中用Dox诱导去除受体小型猪来源的生殖细胞，然后交配产生子代小型猪，研究此种途径获得的子代小型猪携带特定基因的概率是否比一般途径的高，这种方法是否可以提高从嵌合体获得纯合体小型猪的效率。以去除生殖细胞的小型猪为受体，研究干细胞移植治疗的可能性和方法。2）.缺失抑制素a亚基的高繁殖力小型猪模型的建立本研究将通过转基因克隆技术建立缺失抑制素a亚基基因的小型猪模型来探索通过修饰改造抑制素a亚基基因后能否提高动物的繁殖力，这将为高繁殖力猪甚至其它哺乳动物新品种的培育，为未来人类疾病模型的建立积累新知识、提出新理论、寻找新思路并创建新方法。本项目将从以下三个途径来实现：建立缺失抑制素a亚基基因的小型猪模型；（结合基因敲除和体细胞克隆技术）；抑制素a亚基基因缺失小型猪的有效性和安全性检测；（检测不同发育阶段和不同后代中抑制素a亚基基因缺失小型猪的生产性能，繁殖性能，各项生理指标，生殖器官及其它器官的发育及病理变化）；揭示抑制素基因与其它基因在调节动物生殖活动中的互作关系；（研究正常和缺失抑制素基因小型猪生殖器官的转录组变化）；本项目技术路线：

小型猪抑制素<1亚基基因的扶得IRT卩CRH■I『敲除抑制素a亚基基因载体的构建I细胞培养J誉染」i敲除抑制素。亚基基因小型猪胚胎成纤维细胞的建立1核移植I：获得敲除抑制素a获得敲除抑制素a亚基基因小型猪模型一小型猪模型病理学评估—>小型精模型转录组学评估3)Oct4-GFP转基因克隆猪模型的制备猪Oct4启动子区域的克隆与序列分析。构建猪Oct4-GFP报告载体poct4-GFP-neo载体将载体pEGFP-N2中的CMV启动子替换成猪Oct4启动子，构建poct4-GFP-neo载体。猪Oct4启动的有效性及特异性的验证。质粒poct4-GFP-neo转染猪IPS细胞，同时以pcmv-GFP为对照，观察两种质粒转染后GFP在IPS细胞及feeder细胞的表达。证明猪Oct4启动子调控的GFP仅在IPS细胞表达。从而验证其有效性及特异性。线性化载体poct4-GFP-neo，脂质体转染猪胚胎成纤维细胞，经G418筛选获得阳性转基因细胞克隆。以poct4-GFP-neo转基因猪胚胎纤维细胞为供体，本细胞核移植获得转基因体细胞克隆胚胎。观察胚胎不同时期GFP表达，并利用免疫荧光技术同步观察内源性Oct4基因的表达。胚胎移植，获得oct4-GFP转基因克隆猪。克隆猪的鉴定和检测。4）生殖细胞组织特异性表达的CRE猪模型的制备采用生殖细胞特异性启动子（piwill基因启动子）构建组织特异性表达CRE的载体；线性化后转染小型猪成纤维细胞，筛选阳性克隆，制备克隆猪；所获转基因克隆猪与本课题组已获得的能报告CRE表达的转基因猪杂交；将获得生殖细胞特异性表达绿色荧光蛋白的转基因猪，用于分析示踪生殖细胞的发育过程和轨迹研究。piwill基因启动子的扩增生殖细胞特异性表达Cre重组酶载体的构建小型猪胎儿成纤维细胞制备遗传修饰成纤维细胞制备核移植，胚胎移植,制备遗传修饰克隆猪克隆猪表达Cre的组织分析，遗传修饰克隆猪生理生化

指标分析课题四：发育相关小型猪模型的建立承担单位：昆明医学院、吉林大学、中国科学院广州生物医药与健康研究院；课题负责人：周新富；课题经费比例：30%；主要参加人员：李子义、陆地、张学明、赵本田分别建立几种在神经发育和心血管系统发育研究中具有重要应用价值的小型猪模型，为哺乳动物发育生物学研究提供重要的研究工具。1).成熟BDNF及其前体转基因小型猪模型的建立以基因修饰技术与体细胞核移植技术平台为基础建立仅表达成熟BDNF的猪系：和BDNF前体基因突变的猪系，用于研究成熟的BDNF和proBDNF对神经及其他器官发育的影响。首先，将BDNF的前体域敲除，并通过外源基因过表达技术让猪仅表达成熟的BDNF但不表达前体域。另外，将BDNF前体Furin降解点变异掉，这样该前体就不会被Furin酶及tPA酶降解为成熟的BDNF。结果使小猪只主要表达BDNF前体而非成熟BDNF。2).运动神经元发育小型猪模型建立以有丝分裂后运动神经元的标记基因HB9基因的5'端完整调控区驱动绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达，通过细胞转染获得HB9-GFP转基因猪胚胎成纤维细胞，最终以该体细胞为供体应用核移植技术获得HB9-GFP转基因克隆猪，用于直观性的研究运动神经元发育及功能。3)ISL1+心脏前体细胞发育小型猪模型建立首先从Cre介导的EGFP转基因猪中获得胚胎成纤维细胞。通过电穿孔方法转染敲入载体获得ISL1-CreERT2基因敲入成纤维细胞。再通过核移植技术获得ISL1-CreERT2基因敲入猪。ISL1-CreERT2:EGFP猪获得后，再与EGFP指示转基因猪回交。检测这些双杂合子猪在不同时期的重组效率。向孕猪注射入tamoxifen，检测ISL1-CreERT2控制下的EGFP在不同心脏发生时期的表达情况，确定IS1+前体细胞对不同心脏细胞细胞家系的作用。通过体内跟踪方法，明确猪心脏发生过程中ISL1+心脏前体发育如何分化成系。确定在心脏月牙期ISL1是不是仅仅标记在第二心区（SHF）,明确ISL1在从心脏月牙期到四腔期是一种处于激活状态还是在分化过程中需要重激活。分离出大量ISL1+心脏前体，以猪为动物模型测试其在临床前研究中的治疗可行性。4）WT1-EGFP肾脏、生殖腺发育小型猪模型建立①WT1-EGFP转基因小型猪模型建立及WT1基因组织表达与功能研究构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的WT1表达载体，转染成纤维细胞系，通过体细胞核移植技术，获得WT1-EGFP转基因小型猪动物模型，直观性研究内源性WT1基因在胚胎和成体时期各组织器官内的表达情况。②小型猪WT1基因在肾脏、生殖腺发育中的重要作用通过RT-PCR方法，检测其他肾脏发育相关基因Pax-2、GDNF等在肾脏的表达情况；检测其他生殖腺发育相关基因SRY、SF1在睾丸和卵巢中的表达情况；构建WT1基因高表达载体和表达沉默载体，转染相应细胞，检测Pax-2、GDNF，SRY、SF1的表达。③小型猪WT1基因表观遗传修饰研究运用甲基化特异性PCR检测小型猪肾脏WT1基因启动子区域DNA甲基化状态，并且运用染色质免疫沉淀技术(CHIP)分别检测WT1基因组蛋白乙酰化和甲基化状态。使用去乙酰基酶抑制剂丁酸钠处理小型猪克隆胚胎，运用CHIP技术，比较克隆胚胎和丁酸钠处理克隆胚胎WT1基因启动子序列组蛋白H3、H4乙酰化状态，同时分别运用Real-timePCR技术和WesternBlot技术检测克隆胚胎和丁酸钠处理克隆胚胎WT1基因mRNA水平和蛋白水平表达情况。创新性与特色本项目探讨影响国计民生的的重大科学问题。项目中的四个子课题既相互独立，又交叉互补。这些课题既是有关研究人员各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了优势力量，对生殖发育重要动物模型建立中的核心问题进行多侧面的合作研究。本题目的创新性主要体现在：本项目探讨的问题是国际前沿的科学问题，因此保证了项目的创新性。本项目的选题涉及小型猪基因组学、基因表达调控、生殖发育相关模型的建立等科学问题。将基础科学与实际应用相结合，力争在解答基础科学问题的同时，发展新的动物模型。本项目在充分利用课题组已建立的基因组学研究平台，转基因克隆猪研究平台，生物信息学研究平台的基础上，建立小型猪基因组数据库，分析小型猪基因组特征和早期胚胎基因表达的调控网络和调控机理，填补小型猪研究领域的空白。本项目着眼于技术创新,通过体细胞核移植技术结合多种体细胞基因修饰技术，建立转基因猪和基因打靶猪的技术体系，建立多种生殖生物学和发育生物学中具有重要应用价值的新型动物模型，为生物医学研究提供新的模型工具，必将极大的促进生殖发育研究的深入，加速其研究成果在人类医疗事业上的早日应用。本课题选用我国自行培育的高度近交系版纳小型猪和五指山小型猪作为实验动物显示了独特的资源优势和特色。可行性分析本项目的总体方案是切实可行的。本项目提出的主要科学问题和研究目标不仅具有理论和实际依据，而且都是该领域前沿性和关键性的问题。猪的基因组学及生殖发育猪模型的研究正处于发展的起步阶段，体细胞克隆也正处于平缓发展的时期，这对我国来讲是个难得的走向学术前沿的一个重大机遇。近年来，本次项目申请参与单位积极主动参加国内外召开的该领域相关会议，与该领域的著名学者、同行交流了解国内外动态和发展趋势，并与国内外多家科研机构建立了良好合作关系。项目申请参与单位均有多年从事生殖生物技术、发育生物学、胚胎工程、分子生物学等方面研究的经历，项目负责人也都有在国外知名实验室从事科研工作的阅历。我们联合了该领域取得突出成绩的国内优秀中青年科学工作者。他们都是经历了在国外相关领域知名实验室从事科学研究，学成回国的年富力强的科研人员，也都有参加过国家重大、重点课题项目的经历，具备承担国家项目并取得重要突破的素质。研究课题组成员有深厚的理论知识与丰富的实践经验,熟悉当前的研究现状及方法手段,对本课题的研究具有较强的掌控及应变能力,能保证课题的顺利完成。承担单位有良好的研究条件和研究基础，并已具备了相当规模并取得了很好的科研成果，已具备的条件和研究优势将保证本课题的顺利实现和圆满完成。有国家重点实验室、本研究所涉及的仪器设备和材料均有保障。已经在克隆领域获得了国内外瞩目的成果：项目参与单位的主要人员近年来都在猪的体细胞克隆、家畜多能性干细胞、模式动物胚胎干细胞和成体干细胞应用及基础研究方面获得过成功,a-1,3半乳糖苷转移酶敲除克隆猪、国内首例含多基因克隆猪、均在国内外倍受关注。这将会为本项目的开展及时提供最新信息、深入开展国际合作，把握最新动向提供便利。

四、年度计划硏究内容预期目标1对版纳微型猪近交系和五指山小1完成版纳微型猪近交系和五指山型猪近交系进行全基因组测序；小型猪近交系的全基因组测序；2测定小型猪生长发育指标，建立数2建立小型猪生长发育指标数据库。据库；3成功建立和优化猪体外受精和早3建立和优化猪体外受精和早期胚期胚胎培养条件,获得猪早期培养胎培养条件,对猪不同阶段的早期发育的基因表达数据；胚胎进行取材用测序和芯片分析早4获得转M-Regulator单基因小型第期胚胎基因表达状况包括编码蛋白猪；的基因和miRNA基因：5获得生殖细胞特异性启动子Cre重4选择雄性生殖细胞特异表达基因（如Mvh）的启动子，构建Tet-On组酶的转基因克隆猪5头以上；年6全面分析小型猪抑制素a亚基基因系统的调控部分，制备转基因小型猪结构，成功构建敲除小型猪抑制素aM-Regulator；亚基基因载体。5猪Oct4启动子区域的克隆与序列分析；转基因载体构建，遗传修饰成纤维细胞制备与遗传修饰猪胚胎制7构建出各突变表达载体；8建立相应转基因干细胞系；9获得ISLl-CreERT2基因敲入成纤备，获得生殖细胞特异性表达Cre重组酶的转基因克隆猪；维细胞10.构建WT1-EGFP融合表达载体

硏究内容预期目标6小型猪抑制素a亚基基因全长序列并建立WT1-EGFP转基因猪耳尖成的获得及信息学分析构建敲除小型纤维细胞系；猪抑制素a亚基基因载体；11.检测小型猪肾脏、生殖腺各发育7APP/PS1-/-，a-synuclein-/-，相人基因在肾脏和生殖腺的mRNAS0D1-/-，matureBDNF-/-、表达水平；揭示WT1基因和其它肾pro-BDNF-/-等突变表达载体的构建脏、生殖腺发育相关基因表达调控的8突变表达载体植入干细胞核建立各转基因干细胞系及相应生理生化特征研究。9从Cre介导的EGFP转基因猪中获得胚胎成纤维细胞。通过电穿孔方法转染敲入载体获得ISL1-CreERT2基因敲入成纤维细胞。10.构建WT1-EGFP融合表达载体并建立WT1-EGFP转基因猪耳尖成纤维细胞系；11小型猪WT1基因在肾脏、生殖腺发育形成中的重要作用①取成年小型猪肾脏、生殖腺，佥测Pax-2、GDNF,SRY、SF1的mRNA相关机制。

硏究内容预期目标水平表达；②建立相应上皮细胞系，设计RNAi序列，构建WT1基因沉默载体并转染上皮细胞系，检测Pax-2、GDNF，SRY、SF1的表达情况。1对小型猪的测序结果进行基因组/1完成测序结果分析找出与人类疾基因变异/多态性、基因调控、基因病相关基因在小型猪里的直系同源挖掘等多个方向分析进行全基因组基因，建立小型猪全基因组数据库。第解读，进行跨物种基因注释。2建立小型猪生理生化数据库。2测定小型猪生理生化指标包括血常规指标，血液生化指标、临床生理3获得一批对早期胚胎发育重要的二候选基因，深入了解特定基因的功指标、尿液粪便指标、激素指标和微能。年生物指标等，建立数据库。4获得转F-Regulator单基因小型3对数据库进行分析筛选对早期培猪；养发育重要的候选基因幵始详细分5获得猪Oct4-GFP报告载体析它们的功能。poct4-GFP-neo载体；

硏究内容预期目标4选择雌性生殖细胞特异表达基因（如Zp3的启动子构建Tet-On系统的调控部分，制备转基因小型猪F-Regulator；5将载体pEGFP-N2中的CMV启动子替换成猪Oct4启动子，构建poct4-GFP-neo载体；6继续制备生殖细胞特异性表达Cre重组酶的转基因克隆猪；转基因克隆猪生理指标检测与基因表达分析对获得的转基因猪与本课题组前期研究过程中构建的CRE表达报道猪杂交，验证CRE的细胞特异性表达。7将缺失抑制素基因a亚基的表达载体线性化后转染小型猪成纤维细胞，筛选阳性克隆；8利用细胞核移植技术，构建MND转基因小型猪疾病模型及只表达matureBDNF或pro-BDNF转基因小型猪模型；将只表达matureBDNF6获得生殖细胞特异性表达Cre重组酶活性高的转基因克隆猪5头以上;7获得缺失抑制素基因a业基表达载体的阳性克隆成纤维细胞；8成功建立构建转基因小型猪疾病模型的技术方法获得各种稳定的转基因小型猪疾病模型供接下来的实验；9获得ISLl-CreERT2基因敲入猪10构建WT1基因高表达载体，转染细胞后揭示WT1基因和其它肾脏、生殖腺发育相关基因表达调控的相关机制；11建立检测基因DNA甲基化状态的甲基化特异性PCR方法；建立检测基因组蛋白乙酰化和甲基化状态的染色质免疫沉淀技术（CHIP）；揭示WT1基因表达和组蛋白乙酰化、甲基化及DNA甲基化的相关性。

硏究内容预期目标或pro-BDNF转基因小型猪模型与其它疾病模型杂交获得各种基因型的猪系；9.通过核移植技术获得ISLl-CreERT2基因敲入猪。10小型猪WT1基因在肾脏、生殖腺发育形成中的重要作用建立相应上皮细胞系，构建WT1基因高表达载体转染上皮细胞，检测Pax-2、GDNF，SRY、SF1的表达情况。11小型猪WT1基因表观遗传修饰研究巢式甲基化特异性PCR方法检测WT1基因启动子区域DNA甲基化状态；染色质免疫沉淀技术（CHIP）检测成年小型猪肾脏WT1基因组蛋白乙酰化状态；染色质免疫沉淀技术（CHIP）检

硏究内容预期目标测小型猪肾脏WT1基因组蛋白甲基化状态。1完善小型猪基因组数据库的建1完成论文撰写，就小型猪基因组设，整理数据，撰写论文研究发表论文5-10篇。其中影响因2测定小型猪繁殖性能指标建立数子大于5的不少于2篇。第据库。。2建立小型猪繁殖性能数据库。3研究候选基因在猪早期胚胎的功3获得特定基因在猪早期胚胎发冃三能。中的功能。发表文章2-3篇，培养研4在Tet-On系统的效应部分，插入究生2-3名年白喉毒素A(diphtheriatoxinA,4为犬得转DTA-Responder单基因小DTA）的表达序列，制备转基因小型猪；型猪DTA-Responder；5验证Oct4启动子的有效性及特异5用质粒poct4-GFP-neo转染猪IPS性；

硏究内容预期目标细胞/同时以pcmv-GFP为对照，观察两种质粒转染后GFP在IPS细胞及feeder细胞的表达。证明猪Oct4启动子调控的GFP仅在IPS细胞表达。从而验证其有效性及特异性。6以前二年实验中确定的生殖细胞特异性表达Cre，并具有较高活性的转基因克隆猪繁育，制备纯合子猪；7以缺失抑制素基因a亚基表达载体的阳性克隆成纤维细胞为供体经体细胞核移植获得转基因体细胞克隆胚胎；8转基因动物模型的行为学、形态学和生理生化学特征研究；9ISLl-CreERT2:EGFP猪获得后，再与EGFP指示转基因猪回交。检测这些双杂合子猪在不同时期的重组效率，向孕猪注射入tamoxifen，检测ISL1-CreERT2控制下的EGFP在不同心脏发生时期的表达情况，确定IS1+前体细胞对不同心脏细胞细胞6获得生殖细胞特异性表达Cre的纯合子猪10头以上；7获得缺失抑制素基因a业基表达载体的阳性转基因体细胞克隆胚胎；8获得转基因动物模型的行为学、形态学和生理生化学数据；发表SCI论文2-3篇。培养硕士、博士研究生2-3名。9检测ISL1-CreERT2控制下的EGFP在不同心脏发生时期的表达情况，确定IS1+前体细胞对不同心脏细胞细胞家系的作用；10了解克隆小型猪不同胚胎时期和成体各器官的WT1基因表达情况；发表SCI论文1-2篇。培养硕士研究生和博士研究生2-3名。

硏究内容预期目标家系的作用。10WT1-EGFP转基因小型猪模型建立及WT1基因组织表达与功能研究运用体细胞核移植技术，制备WT1-EGFP转基因克隆小型猪；荧光显象系统下通过EGFP的表达上匕较克隆小型猪不同胚胎时期各器官和成体各器官的WT1基因表达，深入了解和研究WT1基因在各器官执行的作用及功能。1.测定小型猪免疫学指标，建立数1.建立小型猪免疫学指标数据库。据库；2.获得猪早期胚胎的表观遗传修饰第2•研究猪早期胚胎的表现遗传修饰状况。发表文章2-3篇，其中至少一状况；篇影响因子大于5，培养研究生2-3四3将M-Regulator、F-Regulator和名；DTA-Responder转单基因小型猪交3获得转一基因猪初步获得生殖细年配产生转三基因小型猪“DTA胞去除后的表型；On-GermOut”，研究生殖细胞去4经G418筛选获得阳性转除后的表型；poct4-GFP-neo基因细胞克隆；获得4线性化载体poct4-GFP-neo，脂质阳性转poct4-GFP-neo基因体细胞克

硏究内容预期目标体转染猪胚胎成纤维细胞，经G418筛选获得阳性转基因细胞克隆；以poct4-GFP-neo转基因猪阳性胚胎成纤维细胞为供体经体细胞核移植获得转基因体细胞克隆胚胎。观察胚胎不同时期GFP表达，并利用免疫荧光技术同步观察内源性Oct4基因的表达。5对获得的纯合子转基因猪与本课题组前期研究过程中构建的CRE表达报道猪杂交，验证CRE的细胞特异性表达建立所获转基因小型猪的遗传、生理生化等相关指标；6胚胎移植，获得缺失抑制素基因a亚基阳性转基因克隆猪。克隆猪的鉴定和检测；7MatureBDNF、proBDNF以及MND转基因动物模型的行为学、形态学和生理生化学特征研究；8通过体内跟踪方法,明确猪心脏发生过程中ISL1+心脏刖体发育如何隆胚胎；5获得生殖细胞特异性表达Cre重组酶活性高的转基因克隆猪10头以上，建立所获转基因小型猪的遗传、生理生化等相关指标；6获得缺失抑制素基因a业基的阳性转基因克隆猪；7了解MND、matureBDNF、proBDNF转基因小型猪模型不同胚胎时期和成体个器官的基因表达情况;发表SCI论文2-3篇。培养硕士、博士研究生2-3名。8明确猪心脏发生过程中ISL1+心脏刖体发育如何分化成系，明确ISL1在从心脏月牙期到四腔期是一种处于激活状态还是在分化过程中需要重激活；9丁酸钠对克隆胚胎整体组蛋白乙酰化水平的影响；WT1基因H3、H4组蛋白乙酰化对克隆胚胎发育的影响。

硏究内容预期目标分化成系。确定在心脏月牙期ISL1疋不疋仅仅标记在第—心区（SHF）,明确ISL1在从心脏月牙期到四腔期是一种处于激活状态还是在分化过程中需要重激活。9WT1基因组蛋白乙酰化对体细胞克隆小型猪胚胎的影响丁酸钠处理供体细胞，卵母细胞及克隆胚胎后胚胎发育率及H3K14免疫荧光染色后整体组蛋白乙酰化水平检测；CHIP技术检测克隆胚胎和丁酸钠处理克隆胚胎WT1基因启动子序列组蛋白H3和H4的K位点乙酰化状

硏究内容预期目标1.测定小型猪遗传背景，建立数据1.建立小型猪遗传背景数据库，整库。整合各个数据库，建立小型猪生合建立小型猪生殖发育综合数据库。殖发育综合数据库。2.获得早期培养发育关键基因的调2.构建早期胚胎发育关键基因的调控网络以及表观遗传调控状况。发表控网络以及表观遗传调控状况。影响因子大于5的文章2篇以上培3在“DTAOn-GermOut”小型猪模养研究生4-5名型基础上研究该模型在Dox诱导后，3获得“DTAOn-GermOut”小型猪雄性和雌性生殖细胞（精子和卵子）模型在经Dox诱导后，精子和卵子第的存活状态、生殖器官（睾丸和卵巢）的存活状态、睾丸和卵巢的生理状的生理状态、以及动物个体的发育状态、以及动物个体的发育状况相关数五况；据；年4胚胎移植，获得oct4-GFP转基因4获得oct4-GFP转基因克隆猪；克隆猪。克隆猪的鉴定和检测；5获得生殖细胞条件性基因敲除猪；5将所获得的猪与本课题组其他实6抑制素a亚基基因缺失小型猪牛验过程中建立的基因含loxp的猪杂殖生理活动和生殖内分泌的变化各交，获得生殖细胞条件性基因敲除个器官的发育能力和可能的病理变猪，确定条件性敲除的基因在生殖细化数据；胞及生殖过程中的作用；7年共培养研究生15名，发表SCI6在建立的小型猪模型的基础上研论文15篇；究抑制素a亚基基因缺失小型猪生8提出matureBDNF、proBDNF对

硏究内容预期目标殖生理活动和生殖内分泌的变化各个器官的发育能力和可能的病理变化；研究正常和缺失抑制素a亚基基因小型猪生殖器官的转录组学变化。7总结数据，发表学术论文，提交报告，完成课题收尾工作。8研究matureBDNF及pro-BDNF对AD、PD、MND疾病发生、发展的影响，进而确定用BDNF还是其前体分子pro-BDNF对此类疾病进行干预；9分离出大量ISL1+心脏前体，以猪为动物模型测试其在临床刖研究中的治疗可行性；10总结数据，补充实验，发表学术论文提交报告完成课题收尾工作。11WT1基因组蛋白乙酰化对体细胞克隆小型猪胚胎的影响①Real-timePCR技术检测克隆胚胎和丁酸钠处理克隆胚胎不同胚胎发此类疾病的作用及相应的干预方案；9获得在临床刖研究中具有定的治疗可行性的