基因工程中常用的酶

第二章基因工程中常用的酶

第一节限制性核酸内切酶(Restrictionenzyme)一.限制与修饰:1962年Arber,W(瑞士).等提出限制与修饰假说。1968Arber等发现Ⅰ型限制性酶。1968Smith和WilcoxK.W.发现了Ⅱ类限制性酶并阐明其性质。1971Nathans等首次制作酶切图谱。因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。

1962,Arber,1968Smith发现限制性酶W.Arber(1929–)H.O.Smith(1931－)BiozentrumderUniversitätBasel,JohnsHopkinsUniversitySchoolSwitzerlandofMedicine,USA二.限制性内切酶的类型基因工程中最常用的是Ⅱ型酶三.Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式：限制酶来源剪切方式EcoRIEscherichiacoliRY13G↓AATTCPstI Providenciastuartii164

CTGCA↓GBseⅡBacilusstearothermophilusstrain822(HpaⅠ)

GTT↓AAC

四.同裂酶(isoschizomers):切割同一靶序列而来源不同的酶。

MboI:↓GATCGATC

CTAG↑CTAG

BamHI:G↓GATCCCCTAG↑GG

GATCCCCTAGG第二节分子克隆中常用的酶一.连接酶(DNAligase)在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键。

连接酶的功能：(1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口；用途：(1)通过粘端连接DNA分子；(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。二.甲基化酶(methylase)可使DNA甲基化。有两种：

dam甲基化酶和dcm甲基化酶N6A甲基化5`－GmATC－3`C5C甲基化CmCAGG或CmCTGG

用途：保护待克隆的片断。例如构建真核DNA文库时用E.coli甲基化酶修饰DNA片断中的EcoRI酶切位点，然后将修饰的片断与人工EcoRI接头连接，接头用EcoRI切割后，将DNA片断插入噬菌体DNA中。三.DNA聚合酶I(DNAlolymeraseI)DNApolI单链多肽，MW＝109kD,可被枯草杆菌蛋白酶切成两段；C-端大片断(Klenow酶)，MW＝76kD,具5`→3`聚合酶和3`→5`外切酶活性，N-端小片断MW＝36kD,具5`→3`外切酶活性。(一)聚合酶活性：Mg2+DNA＋ndNTPDNA－(pdN)n+nPPi

5`

CCGOHMg2+5`

CCGATACC

3`GGCTATGG

3`GGCTATGG(二)外切酶活性(2)5`→3`外切酶活性:切补作用从游离的5`端降解DNA，对DNA双链部分的磷酸二脂键有切除功能，每次切10nt5`CGCATCTMg2+5`CATCT3`GCGCGTAGA3`GCGCGTAGA(3)3`→5`外切酶活性:校对作用从游离的5`端降解dsDNA和ssDNA5`CGCATCTMg2+5`CGC3`GCG3`GCG(三)在基因操作中的应用(1)缺口平移(nicktranslation),制备探针；(2)填补由限制酶产生的3`凹缺末端；(3)DNA片断的末端标记(用[32P]dNTP填补末端)；(4)用Klenow酶消解由限制酶产生的3`凸出末端；

5`5`klenow四.末端转移酶(terminaltransferase)取自小牛胸腺,催化脱氧核苷酸与DNA的3`-OH结合模板/引物或底物是带有3`-OH基的ssDNA或带有突出的双链DNA。不要求模板。Mn2+或Mg2+ssDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppiCo2+dsDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppi用途：(1)在载体和cDNA上加互补的同聚物接头(Homopolymerictail)

AAAAAAAAAATTTTTTTTTT(2)

用32P进行3`端同