安徽省克氏原螯虾白斑综合征的发生与防治

安徽省克氏原螯虾白斑综合征的发生与防治

皮肤病毒科（wssv）是线头病毒科（nimavirius）的唯一成员，在台湾和大陆沿海地区的早期流行于该市。WSSV的基因组大小约300kb,Marks等1材料和方法1.1材料表面1.1.1样本采集和保存本实验于2016年4—8月在安徽省滁州、合肥、安庆、六安、池州和芜湖市的8个克氏原螯虾养殖场采集9个样本,样本4与5采自同一个养殖场的不同塘口,各样本取虾20~30只,体重约20g,所有样本采集后均置于-80℃冰箱保存备用。9个采样点中有2个在养殖期间未出现爆发性死亡,其他采样点均出现爆发性死亡,详见表1。1.2方法1.2.1pcr扩增条件取适量克氏原螯虾鳃组织进行研磨,用TIANampGenomicDNAKit(离心柱型DP304)提取DNA,采用WSSV国标GB/T28630的方法进行PCR扩增,套式PCR的引物及反应条件见表2。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。1.2.2f65、orf钢的基因组化和分布用鳃组织抽提的DNA扩增WSSV可变区ORF75、ORF94和ORF125序列。PCR反应体系:无菌蒸馏水33.5μL,10×PCR缓冲液5μL(含1.5mmol·L1.2.3dna纯化回收WSSV可变区ORF75、ORF94和ORF125阳性PCR产物经TakaraMINIBESTagarosegelDNAextractionkit纯化回收,与pMD18-T连接,然后转化感受态DH5a,接着涂布于含氨苄青霉素(100μg·mL2结果与分析2.1无线传感器网络系统的测试结果采集的9个养殖克氏原螯虾样本均在第1轮WSSVPCR扩增中获得阳性结果。2.2基因型和基因型检测bp池州样本8可变区ORF94扩增出2个扩增子,其他样本均产生单扩增子(见图1)。10个扩增子中含5种不同大小的片段,大小为428~968bp,对应的54bp重复单元(repeatunit,RU)基因型为5个,RU数量为2、4、7、8和12,分别从5个(六安、滁州和安庆)、2个(芜湖和合肥)、1个(合肥)、1个(池州)、1个(池州)样本中检出(表3)。这些扩增子在RU第48位碱基上出现G或者T的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),但同一基因型的扩增子序列完全一致。2.3扩增子ros排列9个样本ORF75扩增均获得1个扩增子,结果见图2。扩增子的序列为717~1376bp,每个扩增子均存在2种RUs,45bp和102bp,2种RUs总数为3、6、9、10和11(见表4)。9RUs来自5个样本(合肥、六安和滁州),排列顺序均为45、102、45、102、3×45、102和45,其他4个样本扩增子RUs数量及排列方式均不相同。除池州样本8的扩增子RUs排列以102和2×45开头外,其他的RUs排列均以45、102和45开头,第4个RU出现差异。获得扩增子在45bpRU的第3、15、30、40、42和44位点和102bpRU的第3、15、25、30和83位点存在SNPs。9RUs的5个扩增子除102bpRU的25位点存在SNP变异外,其他序列一致。2.4pcr扩增结果池州样本8可变区ORF125扩增出2个扩增子,其他样本均扩增出1个扩增子(见图3)。扩增子的序列为652~929bp,RUs为5~9,其中7RUs、6RUs分别从4个、3个样本中扩增(见表5)。扩增子的开始RUs为72bp,比其他RUs多18~20位的GCA碱基。开始RUs具有独特的SNPs,指定为A和B。样本4和5的开始RUs排序为AAB,样本9的排序为AAAB,其他样本的排序均为AB。中间RUs有2~6个,第18,66和69位核苷酸有SNPs,指定为C-F。结尾RUs也具有独特的SNPs,指定为T,T的数量为0~3,不同扩增子间T的序列完全一致。10个扩增子中只有安庆的样本4和5的RUs排列完全一致,滁州的样本1和7的中间RUs第18位存在SNP。3wssvorf65感染克氏原螯虾的基因型研究本研究从安徽省6个市采集的9个养殖克氏原螯虾样本WSSVPCR检测结果均为阳性,从水库和鱼塘取样的6个野生克氏原螯虾样本(合肥5个,舒城1个)PCR检测结果均为阴性(数据未显示),表明目前WSSV主要在安徽人工养殖的克氏原螯虾中流行。本实验9个样本WSSVORF94有5个基因型,RUs为2、4、7、8和12,其中2RUs存在于六安、滁州和安庆的5个样本中,这是国内外最小的常见基因型。海南、广西、江苏、浙江、河北、山东、辽宁、福建、广州、天津和湖北WSSVORF94的RUs为3~14本实验中WSSVORF75扩增子的RUs为3、6、9、10和11,其中9RUs来自合肥、六安、滁州的5个样本,为常见基因型,在国内外,该基因型只在山东胶南检测到本实验WSSVORF125的RUs为5~9,7RUs从六安、合肥和芜湖的4个样本获得,6RUs从滁州和池州的3个样本获得。这2种基因型,在国内广泛分布于江苏、广东、山东、天津和河北本研究中池州样本8可变区ORF94和ORF125均扩增出2个不同大小的扩增子,揭示取样池塘克氏原螯虾体内存在不同基因型病毒混合感染的情况。因样本8的3个可变区产生的扩增子数量不同,去掉该样本数据,发现另8个样本WSSV的ORF94只有3个基因型,ORF75和ORF125均有4个基因型。这与之前的报道不一致,ORF94一直被认为是RU数量变化最多的基因,也因此被认为是3个基因中最适合用于小地理范围进行WSSV基因组变异研究的基因本研究中9个样本均在WSSV第1轮检测中出现阳性,表明样本中均存在大量病毒,但样本2和7取样点克氏原螯虾未出现暴发性死亡,取