叶叶树子层积过程中生理响应的研究

叶叶树子层积过程中生理响应的研究

香树种是樟科多年生灌木和小型植物，树皮呈浅棕色。产于粤华、华南和西南部各省。主要生长在潮湿的山地和稀疏的森林中。耐阴,适应性强,喜温暖气候及湿润、酸性土壤,耐修剪,生长速度中等偏快。全果出油量为40%~60%,种子榨油可食用,也可作为制皂、润滑、油墨、医药等工业原料。香叶树适应性强、生长快,既是优良速生用材和园林绿化树种,又是化工、制药的优质原料,因而开发前景广阔种子休眠是指具有生活力的成熟种子在适宜的萌发条件下仍不萌发的特性,是植物在长期演化过程中为适应环境变化及抵抗不良环境条件所获得的生物学特性。种子休眠的原因很复杂,一般认为导致种子休眠的原因主要有:(1)种皮结构特殊,不透水和气,胚不能吸涨,因而不能进入活跃状态;(2)果皮或胚中有抑制萌发的物质存在;(3)胚未发育完全或某些生理生化过程尚未完成1材料和方法1.1种子层积萌发香叶树果实采于云南省保山市腾冲县,每年10月成熟。收集的果实堆放待果实腐熟变软,捣碎水浸,漂洗出果皮和果肉,多次冲洗去杂,得到纯净种子,自然晾干后贮藏于冷柜中(4℃)备用。首先对种子沙藏的沙土进行质量分数0.1%高锰酸钾消毒,于2009年12月10日将种子埋入沙中进行低温层积处理。层积条件为0~10℃湿藏,保持沙土和种子湿润。每10d对沙藏花盆进行重新倒盆、浇水、混合;每3周取1批种子,共取6次。种子取出后置于4℃冰箱密封保存。层积过程中有胚根萌发时将萌发的种子取走并进行记录,统计萌发率。当胚根突出珠孔1mm时,种子视为已萌发。1.2方法1.2.1种子萌发率测定不同层积时间的种子均先用0.1%高锰酸钾消毒20min,然后用蒸馏水冲洗干净。发芽在培养皿中进行,以2层滤纸作发芽床,每皿处理50粒种子,重复3次,最后转入16L-8D光照培养箱中萌发。每2d浇1次水,每4d更换1次滤纸。分别于20、40、60d之后记录发芽率。以胚根突破种皮、长度为种子一半时为萌发指标,并对发芽情况进行观测、记录。1.2.2吸胀剂的吸收剂为复合液湿法温床取完整种子(去除假种皮,但中种皮完整的种子)25粒,称其气干状态下的干质量,加50mL蒸馏水,放在27℃恒温箱中吸胀,在前12h内每隔4h取出1次,用滤纸吸干表面水分后称其湿重,随后每隔12h取出1次,直至吸水饱和为止。通过对种子吸胀至饱和速率的对比,证明种皮是否对种子萌发具有机械阻碍作用1.2.3胚轴的发育情况取层积不同阶段的种子,解剖观察种胚的形态和大小,以判断在层积过程中胚轴的发育情况。并将层积种子剥去种皮,分离两片子叶,于10倍体视显微镜下观察其胚轴形态。1.2.4实验组和对照组随机取90粒种子,做3组平行试验,沿种胚中央切开,一半作染色组,一半作对照组。将种子切面向下,置于铺有1层滤纸的培养皿中,实验组用质量分数0.5%的TTC溶液浸泡,对照组用水浸泡。置于室温下,于12h后观察染色情况1.2.5总研磨物的蒸发为了检测种子萌发抑制物是否存在,将种子的种胚与种皮分离,各称取7g,置于--20℃预冷的体积分数为80%的甲醇中,4℃浸提48h,提取液于培养皿中蒸发浓缩至7mL(此时对应总研磨物浓度为1g/mL)。6000r/min4℃离心10min取上清,稀释至0.2、0.4、0.6g/mL。用油菜(Brassicacampestris)种子做生物鉴定材料,分别取0.2、0.4、0.6g/mL浓度的香叶树种皮与种胚提取液,并以蒸馏水、体积分数为40%、80%甲醇作为对照,对油菜种子进行常温浸泡2h后,于培养皿中做萌发实验,每个培养皿中放置50粒种子,24h后统计油菜种子发芽率。1.2.6种子在睡觉过程中改变了抗酶系统1.2.6.种子层积的制备在综合4种抗氧化酶提取液配方的基础上,我们统一了提取液配方,即在单一的提取系统中得到粗酶液。提取液配方为:50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0),质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1mmol/L抗坏血酸(AsA)取不同层积阶段种子各15粒(约1g),去皮。液氮中将种子研磨成粉末,分别称取0.2g粉末置于2mL离心管中,每个梯度做3个平行对照。每支离心管中加入2mL提取液,充分混合后14000r/min4℃离心30min;吸取上清1mL于2mL离心管中,并加入提取液1mL,14000r/min4℃再次离心30min,取上清1.5mL,再加入1.5mL由提取液稀释过的体积分数为40%的甘油,混匀即为酶的粗提液。置于超低温冰箱中冻存。1.2.6.活性成分的测定1)超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定:显色反应时,在体系中加入:0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)1.75mL,130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液0.3mL,0.75mmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液0.3mL,0.1mmol/LEDTA溶液0.3mL,0.02mmol/L核黄素0.3mL,粗提酶液0.05mL。另取两管以缓冲液代替酶液的体系做为对照,将其分别置于暗处和照光处。将加入酶液的18只试管和照光对照置于2000lx日光灯下反应20min(确保各管照光均匀)。至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其他各管的吸光度A2)过氧化氢酶(CAT)活性的测定:显色反应时,在体系中加入0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)2.65mL,粗酶液0.05ml,最后加入0.1mol/LH3)过氧化物酶(POD)活性的测定:显色反应时,在体系中加入0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)1.0mL,0.05mol/L愈创木酚2.5mL,粗酶液0.1mL,最后加入体积分数2%过氧化氢启动反应。以磷酸缓冲液代替酶液作为空白对照。在体系中加入过氧化氢后立即倒入比色皿开始读数,随后每1min读数1次,读4min,记录5组数据。反应结束后,以每分钟A4)抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定:显色反应时,在体系中加入0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)2.65mL(含1mmol/L抗坏血酸AsA),粗酶液0.05mL,最后加入25mmol/L过氧化氢启动反应。以磷酸缓冲液作为空白对照。在体系中加入过氧化氢后立即倒入比色皿开始读数,之后每1min读数1次,读4min,记录5组数据。反应结束后,以每分钟A1.2.7硫代巴比妥酸tba取不同时间梯度种子各15粒(约1g),去皮后研碎,分别称取0.2g于4mL离心管中,每个梯度做3个平行对照。加质量分数为5%的三氯乙酸溶液4mL,混合后12000r/min离心20min;吸取上清2mL,加质量分数为0.67%硫代巴比妥酸(TBA)溶液2mL,在100℃沸水浴上煮沸30min,冷却后再12000r/min离心20min。测定吸光度时,分别测定离心后上清液在450、532和600nm处的吸光度值,并按照公式C=6.45(A2结果与分析2.1种子发芽率的影响从图1可以看出:随着种子层积时间的延长,种子发芽率有了明显的增加。未层积前,种子仅有1%的发芽率;当种子层积达到11周时,种子发芽率达到15%;到层积16周时,种子发芽率增加一倍。这表明层积低温层积处理可以有效地打破种子休眠,层积后期效果更为显著。2.2种子的吸水性从图2可以看出:完整的香叶树种子前10h种子的吸水速率直线上升,10~40h之间种子的吸水速度减慢,吸胀40h后达到饱和。由此可见,香叶树种皮的机械硬度较小,吸水至饱和的时间较短,可判定种皮对发芽几乎没有机械抑制作用。2.3种子胚轴的变化通过对层积过程中的种子进行胚轴发育情况观察,发现在整个层积过程中,种子胚轴大小变化较小(图3),表明香叶树种子不具有胚形态后熟的现象,休眠源于生理原因的后熟。2.4不同种子缺少氧化应因子通过TTC对种胚进行染色,可观察到随着种子层积时间增长,被染红种子数量增加,种子内脱氢酶活性呈增加趋势,种子活力不断加强。染色率由未进行层积种子的37%,上升至层积16周种子的79%(图4)。2.5种子萌发率的测定以油菜种子作为生物鉴定材料,测定香叶树种皮与种胚中抑制物的存在。从油菜种子的萌发率可以看出,香叶树种胚与种皮中都含有一定量的抑制物,种胚中抑制物的含量要高于种皮。当抑制物浓度较小时,几乎没有抑制作用,但当其积累到一定量后,会对种子萌发产生一个较为明显的抑制作用(表1)。2.6种子活性的变化从图6可以看出:在种子低温层积过程中,种子内代谢活动增加,其抗氧化酶系统的4种酶(SOD、CAT、POD、APX)活性产生了不同的变化趋势。在层积过程中,SOD和CAT两种酶的活性均是在出现一个下降过程后又开始逐步上升,推测可能是休眠种子的一种自我保护机制。而POD和APX两种酶的活性整体呈增加趋势,但是增加过程中出现了不同幅度的波动,推测出现波动的原因与层积时水分条件及温度的变化有关。2.7过氧化mda植物器官衰老时或在逆境条件下,往往发生质膜过氧化作用。丙二醛(MDA)是其产物之一,通常利用它作为脂质过氧化指标,表示细胞质膜过氧化程度。随着层积时间的延长,MDA的含量下降。但在层积处理后期,MDA含量变化不明显,表明种子活力已经基本恢复(图7)。3种子后熟的影响种子萌发和TTC染色结果表明,随着层积时间增长,种子活力有了较大幅度的增加,当层积达到16周时,种子发芽率达到最大。从层积后期中取出的、未进行任何发芽措施的种子已经具有约32%的发芽率,这一结果说明低温层积处理对打破香叶树种子休眠具有重要作用。香叶树种子在收获后,种子的胚轴还不具备发育的条件,虽然有适宜的温度及水分,但仍然难以萌发,即种子存在生理后熟现象。种胚的发育需要经过一个低温(4℃)湿藏过程,将内在的抑制种子萌发的因素消除,种子开始萌发。本实验结果与其他有花林木种子休眠萌发结果相一致从种子吸水性测定结果可以发现,香叶树种子能较快吸胀饱和;对种子进行剥皮时也能发现,香叶树种皮机械强度较小,非常易于去皮。因此可以得出结论:在香叶树种子的萌发抑制中,其种皮的机械抑制作用可以忽略。在导致种子生理休眠的