山东农业大学生化

有些内容较多，可以根据情况筛选主要内容作答。版权归陈所有。1单体酶:一般只有一条肽链组成的酶，如羧肽酶A，也有少数由多条肽链组成，如胰凝乳蛋白酶由3条肽链组成，链间以二硫键相连构成一个共价整体。寡聚酶：有两个或两个以上亚基组成的酶，亚基间靠次级键结合，彼此容易分开，如大多数调节酶。2单纯酶：分子中只含有氨基酸的酶，如胃蛋白酶等水解酶。复合酶：又称全酶，由酶蛋白（脱辅酶）和非蛋白质（辅因子）两部分组成，非蛋白质部分包括辅助因子（多为金属离子）、辅酶、辅基。如脱氢酶，转氨酶等。3全酶：又称复合酶或结合酶，同上。辅酶：与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质，通过透析方法可以除去，如辅酶I和辅酶II等。辅基：以共价键和脱辅酶紧密结合，不能通过透析除去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白质分开，如细胞色素氧化酶中的铁卟啉。辅酶或辅基的区别只在于它们与脱辅酶结合的牢固程度不同，并无严格界限，它们在酶催化中通常起着电子、原子、和某些化学基团的传递作用。4多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成，其相对分子量很高，如脂肪酸合成酶复合体有7种酶和一个酰基携带蛋白组成。5组成酶：是细胞以恒定速率和恒定数量生成的酶类，是细胞中天然存在的，其含量较稳定，一般不受外界影响。诱导酶：是细胞中进入特定的诱导酶后，被诱导生成的，其有无和含量的多少受外界条件的影响。6酶的比活力：也称比活性，代表酶的纯度，指每毫克蛋白所含的酶的活力单位数，对于同一种酶而言，酶的比活力越高，纯度越高。7酶的纯化倍数：酶纯化过程中每一步骤所得的比活力与第一步骤的比活力之比值，起始时的纯化倍数定为1。8酶纯化的回收率：纯化过程中每一步骤所得的总活力与第一步骤的总活力之比值，以百分比表示。9酸碱催化：通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。分为广义酸碱催化和狭义酸碱催化两种。10共价催化：又称亲核催化或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。11变构酶：具有变构调节作用的酶成为变构酶，具有协同效应，其0】对V的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），都不符合米氏方程。变构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，成为别构调节。（共价调节酶）在其它酶的作用下，对其结构进行可逆的共价修饰，使之处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶的活性。最常见的是可逆磷酸化修饰。2化学修饰酶：通过对酶分子的化学修饰改变酶的性能，以适用于医药的应用及研究工作的要求。化学修饰的途径可以通过对酶分子表面进行修饰，也可对酶分子的内部修饰，其主要方法有：化学修饰酶的功能基、交联反应及大分子修饰作用。13同工酶：是指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的酶，能催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构理化性质和免疫性等方面都存在明显差异的一组酶。如乳酸脱氢酶有5种同工酶。14酶反应的初速率：指在酶促反应过程中，初始底物浓度被消耗5%以内的速度。15酶的转换数：当酶被底物完全饱和时，每单位时间内每个酶分子所能转换的底物分子数，这个常数叫做转换数（TN），通称为催化常数（Kcat）.Kcat值越大表示酶的催化效率越高。16酶的必需基团：17酶的亲和标记：Ks型不可逆抑制剂具有底物类似结构同时还带有一个活泼的化学修饰基团，可通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记，抑制酶的活性，称为亲和标记。18Ks型不可逆抑制剂：属于专一性不可逆抑制剂，又称为亲和标记试剂，具有与底物类似的结构，还带有一个活泼的化学基团，可通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记，抑制酶活性，专一性有一定的限度。Kcat型不可逆抑制剂:也属于专一性不可逆抑制剂，又称为自杀性底物。不但具有与天然底物类似的结构，且本身也是酶的底物，还有一个潜伏的反应基团，可作用于酶活性部位的必需基团或辅基上，使酶不可逆失活，专一性极高。19过渡态底物类似物：化学结构类似于过渡态底物的物质，其对酶的亲和力远大于底物，可作为酶的竞争性抑制剂，引起酶的强烈抑制，这类物质称为过渡态底物类似物。20K型效应物：凡是改变底物的K05而不改变反应Vmax的效应物成为K型效应物。（如竞争性抑制剂） ^V型效应物：凡是改变Vmax而不改变底物K05的效应物称为V型效应物。（如非竞争型抑制剂）21酶工程：主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。22生物酶工程:是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，因此，又可称为高级酶工程。主要把包括3个方面内容：用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶）；设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。化学酶工程：又称为初级酶工程，是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。23固定化酶：是20试剂60年代发展起来的一项新技术。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。经过固定化的酶不仅具有高的催化效率和专一性，而且提高了对酸碱和温度的稳定性，增加了酶的使用寿命。24模拟酶：模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成的人工酶催化剂称为模拟酶。二问答题1何谓酶活力？测定酶活力的原理？测定酶活力的方法?并简述这些方法的测定原理。答：酶活力又叫酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的速率来表示，两者呈线性关系。测定酶活力就是测定酶促反应的速率。酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示，但在酶活力测定实验中底物往往是过量的，因此底物的减少量只占总量的极小部分，测定时不易准确，而相反产物从无到有，只要方法够灵敏，就可以准确测定，因此在实际测定中一般以测定产物的增加量为准。产物生成量对反应时间作图，曲线的斜率表示该相应时间的反应速率，但随着时间延长由于底物浓度降低、产物对酶的抑制或激活等使酶促反应速率降低，这时的反应速率不能代表真实的酶活力，因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率。测定酶活力的方法常用的有以下几类：（1）分光光度法：主要利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当波长，测定反应过程中反应进行的情况，而且一些原来没有光吸收变化的酶反应也可以通过酶偶联分析法来进行测定。（2） 荧光法：主要根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定。（3） 同位素测定法：用放射性同位素的底物，经酶作用后所得到的产物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位。（4） 电化学法：最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的PH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用PH的变化来测定酶的反应速率;也可以用恒定PH测定法，在酶反应过程中，所引起的H+变化，用不断加入的碱或酸来保持其PH恒定，用加入的酸或碱的速率来表示反应速率。此外还有一些测定酶活力的方法，如旋光法、量气法、量热法和层析法等。2温度，PH影响酶活力的机理是什么答：.温度对酶活力的影响表现在两个方面，一方面是当温度刚升高时，与一般化学反应一样，反应速率加快，温度每升高10度，酶反应速率就为原来的2倍；另一方面由于酶是蛋白质，随着温度升高，使酶蛋白逐渐变性而失活，引起酶反应速率降低。酶所表现的最适温度是这两种影响的综合结果。PH影响酶活力的原因可能有以下几个方面：（1） 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。（2） 当PH值改变不是很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。PH影响了底物的解离状态，或者使底物不能与酶结合，或者结合后不能生成产物；PH影响酶分子活性部位上有关基因的解离，从而影响与底物的结合或翠花，是酶活性降低也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物。（3） PH影响维持酶分子空间结构的有关基因解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。3何为酶活性部位？酶活性部位有何特点？研究酶活性的方法有哪些?说明其研究原理。答：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，也就是说，只有少数特异的氨基酸残基参与底物的结合或催化作用。这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域，称为酶的活性部位或活性中心。通常又将酶的活性部位分为结合部位和催化部位，前负责与底物的结合，决定酶的专一性；后者负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能。酶活性部位的特点：（1）活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，通常只占整个酶分子体积的1%-2%。（2）酶的活性部位是一个三维实体。（3）酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置。这个动态的辨认过程称为诱导契合。（4）酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内。底物分子（或一部分）结合到裂缝内并发生催化作用。（5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上。酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。（6）酶活性部位具有柔性或可运动性。研究酶活性部位的方法有以下几种：（1） 酶分子侧链基团的化学修饰法A非特异性共价修饰某些化学试剂能和酶蛋白中氨基酸残基的侧链基团反应而引起共价结合、氧化或还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变。如果某基团修饰后不引起酶活力的变化，可以初步认为，此基团可能是非必需基团；反之如修饰后引起酶活力的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。B特异性共价修饰某一种化学试剂专一的修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使酶失活。通过水解分离标记的肽段，即可判断出被修饰的酶活性部位的氨基酸残基。C亲和标记法人工合成一些与底物结构相似的共价修饰剂，利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记，称为亲和标记。（2） 动力学参数测定法活性部位氨基酸残基的解离状态和酶的活性直接相关，因此通过动力学方法求得有关参数后，就可对酶的活性部位的化学性质作出判断。从pKm或logVmax相对PH的关系，可得到参与反应有关的解离基团的pK值，便可i知道哪个氨基酸残基与酶活性有关。（3） X射线晶体结构分析法 X射线晶体结构分析法可以解析酶分子的三维结构，有助于了解酶活性部位氨基酸残基所处的相对位置与实际状态，以及与活性部位有关的其它基团。（4） 定点诱变法 根据蛋白质结构研究的结果，可以利用定点诱变技术，改变编码蛋白质基因的DNA顺序，研究酶活性部位的必需氨基酸。4使酶具有高催化效率的因素（即酶的催化机理）及作用机制。答：影响酶高催化效率的有关因素讨论如下：（1）底物和酶的邻近效应与定向效应酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变为分子内反应的过程，在这一过程中包括两种效应：邻近效应和定向效应。邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合与同一分子而使有效浓度得以极大的提高，从而使翻译速率大大增加的一种效应。定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。（2）底物的形变和诱导契合当酶遇到其专一性底物时，酶中的某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，底物份子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。（3）酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制，可分为广义酸碱催化和狭义酸碱催化两种。影响酸碱催化反应速率的因素有两个，及酸或碱的强度（pK值）及质子传递的速率。（4）共价催化又称为亲核催化或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。（5）金属离子催化金属离子通过3种主要途径参加催化过程：A通过结合底物为反应定向；B通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；C通过静电稳定或屏蔽负电荷。（6）催化和协同效应在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一起共同起作用。例如胰凝乳蛋白酶是通过Asp102、His57、Ser195组成的电荷中继网催化肽键水解，包括亲核催化和碱催化共同作用。（7）活性部位微环境的影响在酶分子的表面有一个裂缝，而活性部位就位于疏水环境的裂缝里。化学基团的反应活性和化学反应的速率在非极性介质与水性介质有显著差别。当底物分子与酶的活性部位相结合，就被埋没在疏水环境中，这里底物分子与催化基团之间的作用力将比活性部位极性环境的作用力要强得多。这一疏水的微环境大大有利于酶的催化作用。5试述酶活性与一级结构和高级结构的关系。答：6酶的Km值有何意义及作用？如何求得Km？答：Km称为米氏常数，它代表了当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/l，与底物浓度的单位一样。Km值的意义(1)Km是酶的一个特征常熟，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。Km值随特定的底物、反应的温度、PH及离子强度而改变。故对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km值，可用来鉴别酶。Km值可以判断酶的专一性和天然底物。有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。1/Km可近似的表示酶对底物亲和力的大小，1/Km愈大，表明亲和力愈大，显然，最适底物时酶的亲和力最大，Km最小。当k3<<k2时，Km=k2/k1,即Km=Ks。换言之ES的分解为反应的限制速率时，Km等于ES复合物的解离常数，可以作为酶和底物结合紧密程度的一个度量，表示酶和底物结合的亲和力大小。若已知某个酶的Km值，利用米氏方程V=(Vmax+【S】)/(Km+【S】)就可以计算出某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km值往往是不同的，测定两边Km值的差别以及细胞内正逆两向底物的浓度，就可以大致推测该酶催化正逆两向反应的速率，这对了解该酶在细胞内的主要催化方向及生理功能有重要意义。米氏常数可根据实验数据通过作图法直接求得。其中最常用的是双倒数作图法，将米氏方程两侧取双倒数得到下面方程式1/v=Km/Vmax-1/【S】+1/Vmax,以1/V对1/【S】作图，得出一直线。其横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax。7如何鉴定可逆抑制作用和不可逆抑制作用？答：根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类，可逆抑制作用和不可逆抑制作用，有两种方法可供鉴别。物理法可逆抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活；而不可逆抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。动力学法在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率，以初速率对酶浓度作图。在测活系统中不加抑制剂时，初速率对酶浓度作图得到一条通过原点的直线；A当测活系统中加入一定量的不可逆抑制剂时，抑制剂使一定量的酶失活，只有加入的酶量大于不可逆抑制剂的量时，才表现出酶活力，不可逆抑制剂的作用相当于把原点向右移动；在测活系统中加入一定量的可逆抑制剂后，由于抑制剂的量是恒定的，因此得到一条通过原点，但斜率较低于无抑制剂的直线。B如果在不同抑制剂浓度下，每一个抑制剂浓度都作一条初速度和酶浓度关系曲线，不可逆抑制剂可以得到一组不通过原点的平行线，而可逆抑制剂得到一组通过原点但斜率不同的直线。这样可逆抑制作用和不可逆抑制作用从图上就可清楚区分开来。图见王镜岩生化P370。8试述酶的抑制作用类型、特点及抑制原理。答：根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类，可逆抑制作用和不可逆抑制作用。1不可逆抑制作用抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。2可逆抑制作用 抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。根据可逆抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分为3类：A竞争性抑制剂大多数竞争性抑制剂I的结构与底物I结构类似，因此能与酶E的活性部位结合，与酶形成可逆的EI复合物，但EI不能分解形成？,影响了底物与酶的正常结合，酶反应速率降低。其抑制程度取决于底物与抑制剂的相对浓度，这种抑制作用可通过增加底物浓度而解除。米氏方程中Vmax不变Km增加。_B非竞争性抑制剂酶与抑制剂结合后，还可以与底物结合，酶与底物结合后，还可以与抑制剂结合，但中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，其结构与底物无共同之处，两者没有竞争作用，这种抑制作用不能用增加底物浓度来解除。Vmax'Km不变。C反竞争性抑制酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合，但三元中间物不能分解为产物因此反应速率降低。抑制剂与底物分子结构不同，抑制剂只与ES复合物结合，抑制程度取决于抑制剂I和ES两者的浓度。Vmax'Km、。9细胞内酶活性调节和控制的方式有哪些？答：细胞内酶活性调节和控制方式有多种，主要有：1） 调节酶的浓度主要有两种方式：一种是诱导或抑制酶的合成；一种是调节酶的讲解。2）通过激素调节酶活性 激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性。3）反馈抑制调节酶活性 许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质生成的第一步的酶，往往被它们终端产物一直，这种抑制叫反馈抑制。4）抑制剂和激活剂对酶活性的调节 酶受大分子抑制剂或小分子物质（如一些反应产物）抑制，从而影响酶的活性。5）别构调控 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，有些别构剂可使酶活性增加，有些可使酶活性降低。6）酶原的激活 体内合成的蛋白质，有时不具有生物活性，经过蛋白水解酶专一用后，构象发生改变，形成酶的活性部位，变成活性酶。这种调控作用的特点是由无活性状态转变为活性状态是不可逆的，通过专一性的蛋白水解作用来活化酶和蛋白质，在生物体系中是经常发生的。7）可逆的共价修饰 这种调控作用是通过公家修饰酶进行的。共价调节酶通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。8）同工酶 同工酶不仅存在与同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞的不同亚结构中。10变构酶的特点有哪些？答：1）别构酶一般都是寡聚酶，通过次级键由多亚基构成。在其上，有分别负责结合和催化底物的活性中心，，也有和调节物（效应物）结合的调节中心（别构中心）在同粗别构酶中活性部位和调节部位是相同的。2） 别构酶的动力学：因别构酶有协同效应，故其V-[S】的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。3） 凡是改变底物的K05而不改变反应Vmax的效应物成为K型效应物。凡是改变Vmax而不改变底物K05的效应物称为V型效应物。4） 别构酶经加热或用化学试剂等处理后，可引起别构酶解离，失去调节活性，称为脱敏反应，脱敏后的酶表现为米氏酶的动力双曲线。1蛋白质的盐溶：在低浓度的中性盐溶液中，大多数蛋白质的溶解度增加，这种现象成为盐溶作用。盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐类，如硫酸铵，蛋白质的溶解度逐渐下降以致从溶液中沉淀出来，这称为盐析作用。主要是由于大量中性盐的加入，使水分子的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，导致蛋白质水合程度减少，从而使蛋白质溶解度降低，生成沉淀。2Ks分段盐析：在浓盐溶液中，蛋白质溶解度的对数与中性盐的离子强度成反比关系，可用盐析方程式表示为：LogS=LogSo-KsI,Ks为盐析常数，I为中性盐离子强度。分段盐析：PH或温度对盐析的影响程度随蛋白质种类而异，因此可以在一定的离子强度下，改变PH及温度使蛋白质分离，这就是分段盐析。3离子交换层析：利用物质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化目的的，可根根据离子交换剂的不同分为离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶。4高效液相层析：简称HPLC，利用大幅度降低支持物的颗粒度，同时增加压力，以维持必要的流速而设计的层析方法。5吸附层析：利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质的不同而达到分离目的的。吸附过程涉及范德华力和氢键这些非离子吸引力。典型的吸附剂有硅石、氧化铝和活性炭等。6疏水吸附层析：利用蛋白质表面的疏水性发展起来的纯化技术，使用疏水凝胶作为分离介质，在高盐浓度下，蛋白质的疏水性增加，可与疏水性介质结合，然后使盐浓度降低，不同蛋白质因疏水性不同而依次洗脱下来达到纯化目的。7亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效纯化方法，常用的有免疫亲和层析、凝集素亲和层析等。8密度梯度区带离心：如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带，分成区带的蛋白质可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分部收集。9蛋白质的氨基酸组成：指组成蛋白质的每条肽链的氨基酸的种类以及每种氨基酸的数目。10DNS-CI-Edman测序法：DNS法测定肽链的N-末端残基，用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链样品，这样既能提高检出倍释放残基的灵敏度，又能使氨基酸释放依次连续进行。将样品水解后，取少量样品用DNS-CI法测N端氨基酸，已确定第一个氨基酸，再向留下的溶液中加入PITC,在一定条件下反应后，抽提N端形成的PTA-氨基酸异支，再以DNS法测定N端氨基酸，剩下的溶液再按Edman法将N端氨基酸脱除，如此反复测定。11对角线电泳：可用来确定蛋白质中二硫键的位置，把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在PH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同而分离开来。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸汽中，使S-S断裂。这时每个含有二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽。滤纸旋转90度角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大多数肽段的迁移率未变，并位于铝制的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段（未用茚三酮显色的）分别取下，进行氨基酸序列分析，然后与多肽链的氨基酸序列比较，即可推断出二硫键在肽链间或/和肽链内的位置。1T蛋白质的完全水解：将蛋白质分子中所有肽键部位都打断，使其变为游离的氨基酸的水解。蛋白质的部分水解：有选择的打断部分肽键使蛋白质分子变为肽段的水解。13蛋白质组：指一个细胞或组织或机体所包含的所有蛋白质，现将其定义为基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，分析细胞内对动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。14蛋白质微阵列芯片：是将各种蛋白质点样到固体基质表面形成阵列，然后与要检测的组织或细胞等进行杂交，再通过自动化仪器分析得出结果，高通量检测样品中目标蛋白质分子的一种技术。15噬菌体展示技术：是将外源DNA（如单克隆抗体的基因）通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对的空间结构和生物活性，外源基因产物（单抗）在过柱时，如柱上含有目的蛋白质，则可特异的性结合在相应的抗体上。16生物信息学：是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科，是为理解各种数据的生物学意义，运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解析的科学。二问答题1破碎细胞（组织）的方法有哪些，其原因是什么？答：1机械破碎法利用机械力的搅切作用使细胞研碎，常用的器械有高速搅切机、研钵和匀浆机等。2渗透破碎法利用低渗条件使细胞吸涨破碎，例如将红细胞放入水中发生自溶现象。3反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰，在融化膨胀，使细胞涨破。4超声波法 超声波粉碎机利用超声波振荡，使细胞膜上所受张力不均匀而受到解体。5酶消化法 利用蛋白酶、溶菌酶和纤维素酶对细胞膜或细胞壁作用，使它们解体。2根据分子大小不同分离纯化蛋白质的方法有那些？简述这些方法的原理。答：主要有透析、超滤、凝胶过滤法（分子筛色谱）、密度梯度离心和高效液相层析。1透析利用蛋白质大分子不能透过半透膜，而小分子杂质如无机盐、单糖等能透过半透膜的性质，使蛋白质与小分子杂质分开。2超滤利用压力，强行使水和其他小分子杂质透过半透膜，而蛋白质被截留在膜上而达到分离目的的方法，对蛋白质溶液有分级作用，且有浓缩和除盐作用，可分离不同分子量的蛋白质。3凝胶过滤法当大小不同的蛋白质分子混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶珠网孔大的蛋白质分子不能进入网孔内，而被排除在凝胶颗粒外，随着缓冲液往下流动，并最先流出柱外；而比网孔小的蛋白质分子可不同程度的进入网孔内，进入网孔的程度不同，因此流速也不同，从而达到分离的目的。4密度梯度离心蛋白质颗粒的沉降速度与分子大小和密度都有关。在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比小的沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度中，介质密度梯度主要起一种稳定作用。5高效液相层析在层析过程中，支持物颗粒越小，对样品分离效果越好，然而支持物颗粒过细会使流速变得很慢，同时增加纵向扩散的影响，对提高柱分离效果不利，为了既能提高分离效果，又不会使实验时间延长，可采用大幅度降低支持物的颗粒度，同时增加压力以维持必要的流速的方法。3使蛋白质沉底的方法有那些？简述各种方法的原理。答：主要有盐析法、等电点沉淀法、蛋白质沉淀剂法和有机溶剂沉淀法。1盐析当盐浓度增高时，如半饱和或饱和状态，蛋白质溶解度降低，从溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。主要是由于大量中性盐的加入，使水分子的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，导致蛋白质水合程度减少，从而使蛋白质溶解度降低，生成沉淀。2等电点沉淀法蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，因此在其它条件相同是，它的溶解度达到最低点。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。3蛋白质沉淀剂法 向细胞抽提液中加入沉