应用液基微量稀释法测定抗真菌药物对拉曼色菌的最小抑菌浓度

应用液基微量稀释法测定抗真菌药物对拉曼色菌的最小抑菌浓度

马鞭草属于母乳菌。有许多疾病，如花斑疹、马鞭草、毛囊炎、脂肪性皮炎、银屑病、伤口等。治疗后易复发或再感染,难以根除,需要反复或长时间抗真菌治疗。马拉色菌一般分为7种:糠秕马拉色菌,球形马拉色菌,钝形马拉色菌,厚皮马拉色菌,斯洛菲马拉色菌,限制马拉色菌和合轴马拉色菌。除厚皮马拉色菌外,其余6种的生长需要脂肪11.1药物来源与合成试剂菌株共17株马拉色菌,7株为马拉色菌标准株(协和医科大学南京皮肤病研究所惠赠);10株为马拉色菌临床分离株,取自花斑癣患者皮损处皮屑分离,并培养鉴定。1.1.2培养基LeemingandNortman(LAN)培养基:1%蛋白胨,0.5%葡萄糖,0.1%酵母浸膏,0.4%干燥牛胆汁,0.1%甘油,0.05%单硬脂酸甘油脂,2%橄榄油,0.05吐温-60,1%全脂牛奶,1.2%琼脂(0.05%氯霉素);LAN液态培养基:质量分数为1%蛋白胨,0.5%葡萄糖,0.1%酵母浸膏,0.4%干燥牛胆汁,0.1%甘油,0.05%单硬脂酸甘油脂,0.05吐温-60,1%全脂牛奶,1.2%琼脂(0.05%氯霉素)。1.1.3药物来源与纯度伊曲康唑由天津医药工业研究院提供,批号95-10-02,纯度99.99%;氟康唑由上海三维制药公司提供,批号99-08-05,纯度99.55%;咪康唑由杭州医药物资公司提供,批号99-11-18,纯度90%;酮康唑由宁波倍的福药业有限公司提供,批号99-10-06,纯度99%。联苯苄唑由北京四环制药厂提供,批号99-08-03,纯度99.88%;环吡酮胺由北京万辉药业集团提供,批号99-10-02,纯度99.55%;特比萘芬由山东齐鲁制药公司提供,批号02-08-15,纯度99.99%。1.2方法1.2.1建立一个人工林用DMSO溶解稀释抗真菌药物至储存液浓度为1280μg/ml,置于无菌聚乙烯小瓶-70℃保存。取药物储存液100μl加入900μlLNA液态培养基。即初始浓度为128μg/ml。1.2.2菌落菌的制备将受试菌编号连续传代培养2次,第2次32℃传代培养4天后,用无菌生理盐水洗脱纯化菌落,制成菌悬液,并调整其至迈氏比浊管数值1,经血细胞计数仪计数其菌含量为(1.0~2.0)×101.2.3生长对照试验取96孔微量板第2孔至第11孔加培养基100ml,第1孔加稀释后药液200μl,然后自第1孔吸100μl药液加入第2孔依次做递倍稀释,至第10孔混合后弃100μl,第11孔作生长对照。第12列留1孔加200μl培养基做空白对照。将真菌接种液依次编号,吸取100μl接种液至第1~11孔,振荡混匀,然后每孔加入5μl橄榄油。1.2.4sdo对照组再设计一排对照为以单纯DMSO为储存液用LNA液态培养基稀释10倍。1.2.5培训接种后的药敏板置于湿盒内,32℃培养72h,每天观察生长情况,以阳性对照空生长良好为准。1.3结果审判肉眼观察到阳性对照孔菌落生长良好。有菌落生长为无抑制作用,无菌落生长为抑制。MIC值:无真菌生长的最低孔药物浓度。2伊曲康唑-蒂康唑的比对见表1。7种抗真菌药的MIC范围为酮康唑<0.125μg/ml,联苯苄唑0.5~2μg/ml,伊曲康唑<0.125~0.25μg/ml,氟康唑8~32μg/ml,咪康唑8~32μg/ml,特比萘芬0.5~4μg/ml,环比酮胺16~32μg/ml,对照二甲基亚砜>64μg/ml。3抑菌活性试验液基微量稀释法是在M27-A方案基础上改进的,将RPMI1640培养基替换为LNA液态培养基,其中含有吐温80,橄榄油等马拉色菌必需的各种生长物质,马拉色菌各型生长良好,试验结果易分析、方便。该法具有观察时间短,重复性好,能检测MIC值,精确,误差小,试验方法简便等优点。在试验中空白对照孔生长良好,未见拖尾现象。DMSO对照组MIC>64μg/ml,说明以DMSO为溶媒对本次试验无任何影响。目前国内尚未见西药对马拉色菌的系统抑菌试验研究。笔者选择了临床常用抗真菌药:酮康唑、伊曲康唑、联苯苄唑、氟康唑、咪康唑、特比萘芬、环吡酮胺。经17株马拉色菌抑菌试验研究(有标准株,也有临床分离株)试验得出7种药物的MIC值。7种药物抑菌效力从高到低依次为酮康唑、伊曲康唑、联苯苄唑、特比萘芬、咪康唑、氟康唑、环吡酮胺。国外Cupta等μg/ml,特比萘芬对7种马拉色菌MIC为0.03~64μg/ml。与之比较本组药物的MIC值基本符合。在本次试验中,笔者未对10株临床分离马拉色菌菌株进行血清及基因分型,因菌株数目较少,故未研究7型马拉色菌对抗真菌药物敏感性差异。酮康唑、伊曲康唑、联苯苄唑、氟康唑、