清肠温中方调控dss诱导溃疡性结肠炎大鼠h17reg免疫平衡及肠黏膜屏障的作用机制

清肠温中方调控dss诱导溃疡性结肠炎大鼠h17reg免疫平衡及肠黏膜屏障的作用机制

溃疡性胃炎（iu）是一种严重的肠病，主要表现为腹痛、腹泻、粘膜脓血便等，严重影响了患者的生活质量。1材料和方法1.1动物、环境、温度24只健康SPF级SD雄性大鼠,体质量(180±220)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0002,饲养于北京中医药大学东方医院动物房。12h光照/黑夜循环,温度20～24℃,湿度50%～60%;自由饮食饮水饲养。1.2青莎草粉添加量清肠温中方配方颗粒:黄连6g,炮姜10g,三七6g,青黛6g,地榆炭15g,苦参15g,木香6g,炙甘草6g。由北京中医药大学东方医院配方颗粒药房统一购于北京康仁堂药业有限公司。1.3便潜血热试试葡聚糖硫酸钠(MW36-50KDa;MPBiomedical,Burlingame,CA,USA),便潜血试纸(珠海贝索生物技术有限公司);ZO-1抗体(Santacruz,SC-8146),Occludin抗体(Abcam,Ab31721)。1.4模型、图纸和样品采集动物模型的建立方法如前期研究1.5逆转录条件按照TRIzolRegent说明书提取RNA。miR-675-5p的逆转录引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGTGTGC-3′。逆转录条件为42℃,60min,72℃5min。逆转录获得的cDNA进行实时荧光定量PCR检测miR-675-5p的表达,以U6作为内参,引物序列见表1,采用21.6肠胃内vdrmnmna、孤核受体rort和叉头蛋白p3坊p的mrna显示提取结肠组织样本的总RNA,逆转录后进行PCR扩增,PCR产物经电泳后,采用21.7esi显示了血清中白细胞介素10il-10和白细胞介素17il-17的发现应用大鼠IL-10、IL-17酶联免疫试剂盒检测大鼠血清IL-10、IL-17的浓度。1.8检测occludin抗体表达4μm厚石蜡切片经过脱蜡、复水、高压修复、封闭后,加入一抗(ZO-1抗体浓度1∶500,Occludin抗体浓度1∶500)、二抗,经过显色、复染、脱水、封片后,200倍镜视野下采集图片,Imageproplus6.0软件分析图像,计算光密度和染色区域总面积,用平均光密度(IOD/area)来进行统计分析。1.9正态分布/方差齐性检验s应用SPSS17.0统计软件。计量资料以(ue0af±s)表示,符合正态分布且方差齐进行单因素方差分析(One-wayANOVA),不符合正态分布或方差不齐进行非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1大鼠结肠mir-975-5p、vdrmna的表达见表3。空白组第8号大鼠在实验第3天不明原因死亡,其余大鼠均耐受实验干预措施,直至实验结束。模型组大鼠结肠组织miR-675-5p的表达水平显著升高(P<0.01),VDRmRNA的表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,清肠温中方组大鼠结肠组织miR-675-5p的表达水平显著降低(P<0.05),VDRmRNA的表达水平显著升高(P<0.05)。2.2式神经原因实验cp3mrna,cp3mrna表达水平见表4。与空白组比较,模型组大鼠结肠组织RORγtmRNA的表达水平明显增高(P<0.05),而Foxp3mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,清肠温中方组大鼠结肠的RORγtmRNA的表达水平明显降低(P<0.05),而Foxp3mRNA的表达水平显著升高(P<0.01)。2.3血清il-17、c见表5。与空白组比较,模型组大鼠血清IL-10明显降低(P<0.01),而血清IL-17明显升高(P<0.05)。清肠温中方干预后,血清IL-10明显升高(P<0.05),而血清IL-17明显降低(P<0.05)。2.4各组zo-1、occludin的比较空白组大鼠结肠组织中的ZO-1、Occludin阳性表达较多,模型组中ZO-1、Occludin阳性表达区域明显减少,经过治疗后,清肠温中方组较模型组的表达相对增强,其组织切片阳性表达染色主要为深棕黄色或褐色,见图1、图2。与空白组比较,模型组ZO-1、Occludin的平均光密度明显降低(P<0.05);清肠温中方治疗后,大鼠结肠的ZO-1、Occludin平均光密度较模型组显著增加(P<0.05或P<0.01),见表6。3模型大鼠肠黏膜屏障修复的意义UC是一种病变局限于黏膜及黏膜下层的结肠及直肠的慢性非特异性炎症性疾病,典型的临床症状为黏液脓血便,其病因尚不明确清肠温中方是本文指导,北京中医药大学东方医院李军祥教授根据多年治疗UC总结的经验方,主要组成为:黄连6g,炮姜10g,青黛6g,苦参15g,三七6g,木香6g,地榆炭15g,炙甘草6g。本方以黄连、炮姜为君药以清热燥湿,温脾止泻;三七、苦参、青黛为臣药以增强清热燥湿之功,并兼化瘀止血之效;以木香、地榆炭为佐药以行气导滞、凉血止血;并以炙甘草为使药以补益脾气、调和诸药。前期临床、动物实验MiR-675-5p是长链非编码RNA(lncRNA)H19的直接转录产物,由LncRNAH19第一外显子区编码生成的。LncRNAH19的高表达可以增加miR-675-5p的释放量,而miR-675-5p可以通过和下游靶基因VDRmRNA的3’UTR以非完全匹配方式相结合,从而干扰和抑制VDRmRNA的翻译,同时还可以通过使靶基因VDRmRNA脱腺苷酸化的作用,增强其对靶基因VDRmRNA的降解,从而降低VDR的表达VDR是类固醇激素/甲状腺激素受体超家族的一员,是一类配体依赖性的转录因子,在人体中广泛表达于各类细胞。VDR一方面可特异性地与维生素D(VD)结合,调节其内生维生素D的活化形式,即维生素D-1,25(OH)Th17/Treg免疫平衡的失调是UC发病的主要因素因此,通过调控miR-675-5p/VDR信号通路修复UC大鼠肠黏膜屏障及调控Th17/Treg免疫平衡成为治疗UC的新的方向。本次研究发现,模型组大鼠结肠miR-675-5p、RORγtmRNA及血清IL-17的表达较空白组明显增高,VDRmRNA、Foxp3mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表达较空白组明显降低,提示miR-675-5p/VDR信号通路参与了UC的发病过程,而经过清肠温中方的干预后,大鼠结肠miR-675-5p、RORγtmRNA及血清IL-17的表达较模型组明显降低,而VDRmRNA、Foxp3mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表达较模型组明显升高,表明清肠温中方可以通过降低miR-675-5p的表达,靶向调控VD