核桃分心木化学成分研究

核桃分心木化学成分研究

核桃心轴，又称核桃内膜，是坚果科植物果核的干燥果皮膜。它是一种脆弱的外观，薄而多弯曲。一般来说，坚果的质量为4%-5%。它是新疆彝族最古老的药物之一，具有利尿、清热、健脾、补肾、涩精等功效。近年来,有关核桃分心木单体化学成分研究的报道已有一些,主要采用柱色谱、高速逆流色谱等1仪器、试药与仪器Waters2695型高效液相色谱仪(配有PDA检测器,自动进样器,美国Waters公司);RIGOLL-3140型高效液相色谱仪(北京普源精电科技有限公司);Agilent1200RRLC-6410QQQ-MS/MS质谱仪(美国Agilent公司);YMC-PACKODS-A分析型色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);YMC-PACKODS-A半制备型色谱柱(250mm×10.0mm,5μm);VarianINOVA-400型核磁共振波谱仪(美国Varian公司);VarianINOVA-600型核磁共振波谱仪(美国Varian公司);旋转蒸发器R-3(瑞士Buchi公司);立式压力灭菌器(上海申安医疗器械厂);酶标仪(美国BIO-RAD公司);倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司);细胞培养箱(美国Thermo公司);NO检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司);SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)。95%乙醇(分析纯,淄博丹阳化工有限公司);石油醚、乙酸乙酯(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司);甲醇(色谱纯,OCEANPAKALEXATIVECHEMICAL.,Ltd);甲酸(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司),高效液相用水(娃哈哈饮用水有限公司);二甲基亚砜(DMSO,北京索莱宝科技有限公司);DMEM培养基(美国Thermo公司);胎牛血清(FBS,美国CLARKBioscience公司);脂多糖(LPS,上海源叶生物科技有限公司)。分心木购于安徽亳州药材市场,小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株购于美国ATCC公司。2实验方法2.1提取和分离2.1.1乙酸乙酯萃取部位粗提物的制备干燥后的核桃分心木药材9kg,粉碎后于95%乙醇中回流提取2次,每次2h,料液比1∶4(w/v),趁热抽滤,合并2次滤液,减压蒸发至无醇味;石油醚萃取6次除去脂溶性成分,剩余水层用乙酸乙酯萃取6次,合并每部分萃取液,减压浓缩干燥得乙酸乙酯萃取部位粗提物47.3g。根据前期研究结果2.1.2脱条件:1010min,分心木A2和C7馏分采用Waters2695型高效液相色谱分析,以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相,流速1mL/min,梯度洗脱(A2洗脱条件:0~10min,15%甲醇;10~11min,15%~30%甲醇;11~40min,30%~40%甲醇;波长:280nm;C7洗脱条件:0~5min,25%~30%甲醇;5~20min,30%甲醇;20~21min,30%~70%甲醇;21~40min,40%~50%甲醇;40~45min,50%甲醇;45~50min,50%~100%甲醇;波长:254nm),其高效液相色谱(HPLC)图见图3。2.1.3化合物的制备分心木A2馏分(600mg),经反相C分心木C7馏分(40mg),通过半制备高效液相色谱分离,采用甲醇-水(50∶50,v/v)等度洗脱,得到化合物9(7.1mg)和10(7.2mg)。2.2抗炎活性实验2.2.1试验产品的制备取化合物1~10,分别用DMSO配制成50mM的溶液作为储备液,加药时用无血清DMEM培养基稀释即可。2.2.2标准曲线的绘制精密吸取1mL培养基于标准品中,摇匀,依次稀释成0、1、5、10、50、100μM的溶液,每孔加50μL,再加入等量的GriessΙ和GriessП试剂,用酶标仪测定540nm处吸光度(OD值),绘制标准曲线。2.2.3no含量测定测定方法参考文献筛选出具有较强NO抑制作用的样品,分别稀释成0.5、2.5、5、25、50μΜ的样品溶液。采用MTT法,检测各浓度化合物对RAW264.7细胞活力的影响,NO含量测定方法同2.2.3所述初筛方法。最后根据2.2.2绘制的NO标准曲线,计算不同浓度样品中NO含量。实验数据采用SPSS17.0软件处理,并用x±s表示,组间差异用T-Test分析。3结果3.1化合物5的合成化合物1白色无定性粉末;ESI-MS:m/z208.1[M+H]化合物2白色结晶;ESI-MS:m/z183.1[M+H]化合物3白色无定性粉末;ESI-MS:m/z190.1[M+H]化合物4白色粉末;ESI-MS:m/z213.1[M+H]化合物5黄色粉末;ESI-MS:m/z617.1[M+H]化合物6黄色粉末;ESI-MS:m/z617.1[M+H]化合物7黄色粉末;ESI-MS:m/z465.1[M+H]化合物8黄色粉末;ESI-MS:m/z465.1[M+H]化合物9白色结晶;ESI-MS:m/z179.1[M+H]化合物10黄色粉末状固体;ESI-MS:m/z303.0[M+H]3.2对细胞活力的影响对化合物1~10进行抗炎活性筛选,结果显示化合物10可显著抑制炎症细胞NO的释放。通过MTT实验测各细