细胞传代、铺板、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项

细胞传代、铺板、冻存、复苏等细胞培养相关2020年9月16日细胞污染铺板不匀密度不合适

问题：状态不佳1.细胞传代3.细胞铺板4.细胞冻存5.细胞复苏目录细胞传代原因及概念：培养的细胞由于细胞增殖，密度过大，出现接触抑制，导致细胞难以继续生长繁殖，甚至死亡，需要进行分瓶培养，将培养的细胞分散，以一定的比例转移到另外的容器中进行培养，即为细胞传代。细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上一次传代至少间隔一天。）。准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。加入1ml胰酶细胞消化液，放入培养箱，并计时，不确定消化时间的，需随时镜下观察，待细胞从完全铺展开的贴壁状态，变成即将悬浮的小亮点时，为最佳。迅速移至生物安全柜，加入等体积的完全培养基，终止消化，全面轻柔吹打，转移细胞悬液至无菌离心管中，离心1000转，3-5min。准备新的培养瓶，加入新鲜的完全培养基4-6ml。离心完毕，轻轻倒掉，加入完全培养基，轻柔吹散，吸取500ul细胞悬液加入培养瓶，轻轻摇动，混匀，放入培养箱。细胞处理过程一切无菌操作均需在生物安全柜中进行

无菌培养基、PBS、试剂等；无菌离心管、培养板、培养瓶、培养

皿、枪头等，在生物安全柜中方能打开。手消毒：75%乙醇/酒精棉球随时消毒。细胞操作过程中，及时盖上盖子（培养皿/板、离心管、培养基等）。操作时，手部和胳膊不要从已开盖的无菌细胞、培养基等上方略过。培养基、PBS、血清等分装使用。无菌试剂、枪头、废液桶等提前摆放得当，以便于操作。X✔细胞铺板常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，用适量的完全培养基重悬细胞。根据需要铺板的数量，用无菌离心管或者培养瓶，配制完全培养基（可多配1-2ml）。吸取适量的细胞悬液，加入到配制的完全培养基中，吹打使充分混匀，立即等量加入到培养板的每个孔中。充分摇匀后，轻轻转移入细胞培养箱中。培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）100%细胞量（105）（约）96孔板0.320.1148孔板0.950.22.524孔板1.910.5512孔板3.831106孔板9.52253.5cm培养皿9.62206cm培养皿21.355210cm培养皿58.11013725cm培养皿2555075cm培养皿7515-30200培养板需要加入培养基的体积以及细胞数量各种规格细胞培养板需要加入的培养基的体积，可以参考下表。细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点：1.

常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-80%），还要综合考虑转染试剂对细胞密度的要求等。2.细胞生长的速度，细胞的大小，细胞处理的时间长度（24h，48h...）。3.根据后续相应检测试剂盒的要求（CCK-8,细胞周期，流式，荧光染色等）。培养板需要加入的细胞量培养板中细胞数量的控制：1.按照经验：一个培养瓶100%满后，大概可铺n个6孔板（2n个12孔板...）等,结合镜下观察，调整浓度。2.

计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）干净的盖玻片0.1ul细胞计数板的使用细胞计数板细胞计数板的使用计算公式：n/4x104

（个/ml）注意:避免有气泡！10-20ul细胞悬液数上不数下，数左不数右计数板中每一方格的面积为0.01cm²，高为0.01cm，这样它的体积为0.0001cm³，即0.1mm³。由于1ml=1000mm³，所以每一大方格内细胞数×10000=细胞数/ml，故可按下式计算：细胞悬液细胞数/mL=4个大格细胞总数/4×10000。细胞铺板均匀的注意事项1.细胞消化离心后，尽量在离心管中吹打均匀后，迅速加入到培养板中。2.最好每加完一个培养板后，吹打混匀一次，再加入到下一个培养板中（对于96孔板，每加三到四行/列后，吹打混匀一次）。3.细胞加入到培养板中后，在操作台上，沿大8字轻轻摇匀，静置数分钟，或者立即平行转移到细胞培养箱中，在此过程中，切记不可晃动培养板，不可撞击等剧烈动作。4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等细胞冻存准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管数配制冻存液；冻存液：10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。冻存程序：A

：1.使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。

2.不使用冻存盒：需要梯度降温，4℃（30min-1h），-20℃（30min），-80℃

过夜，第二天转移入液氮罐中。

B

：使用无血清冻存液：可直接放入-80℃，可长期保存于-80℃冰箱。细胞复苏提前打开水浴锅，设置温度37℃。从冰箱取出完全培养基，置于室温复温。依次把培养瓶/皿、枪头盒、离心管，置于生物安全柜中，紫外照射15-30min。待紫外结束，首先，在培养瓶/皿中，加入适量的完全培养基，并做好标记。从液氮罐或者负80冰箱，迅速取出冻存细胞，转移入37℃水浴锅，使其迅速解冻（1min之内）。解冻后，