多聚酶链式反应扩增DNA片段

多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段脱氧核糖含氮碱基磷酸AGCT1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸一、DNA分子的结构12345O鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸2、脱氧核苷酸的种类A腺嘌呤脱氧核苷酸GCTATGCAGCT3、DNA分子的平面结构氢键5'端3'端5'端3'端4、DNA的立体结构

——双螺旋结构2、时间：细胞分裂间期（有丝分裂间期，减数第一次分裂的间期）1、概念：以亲代DNA为模板，依据碱基互补配对合成子代在DNA的过程。3、场所：主要是细胞核（其次是线粒体、叶绿体）二．细胞内DNA复制的过程4、条件：①模板：亲代DNA的两条母链②原料：游离的四种脱氧核苷酸③能量：ATP④

酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对5、过程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的两条母链为模板，依据碱基互补配对规章，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代DNADNA体内复制（示意）6、复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延长条件组分作用模板DNA的两条单链供应复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子链能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能够从引物的3’端开头连接脱氧核苷酸

1、PCR的技术（DNA体外复制）的条件DNA双链单链变性（加热80-100℃

）复性（缓慢冷却）一、PCR的原理（PCR的技术原理）一、PCR的原理（PCR的技术原理）1234522557294时间（min）温度（℃）适温延长高温变性低温复性重复1~3步30轮3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延长2、步骤：变性——复性——延长PCR技术的原理总结利用DNA分子的热变性原理，通过掌握温度来掌握双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。体外DNA复制的条件：

四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格掌握温度的温控设备。复制的方向：子链的5’端向3’端延长。二、PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5

引物15

引物2第二次复制第一次复制5

5

5

5

5

5

模板DNA5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。每个循环包括：变性——复性——延长从其次轮循环开头，上一次循环的产物也可以作为模板参加反应，并且由引物Ⅰ延长而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延长，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程总结三、PCR反应的实验操作1、PCR仪设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上一台能够自动调控温度的仪器三、PCR反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（筹备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延长第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对比调零→测定→计算（公式见P63）波长260nm处读数蒸馏水做对比50倍（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、

a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的汲取峰，峰值的大小与DNA的含量有关2、过程①稀释2µL

PCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对比调零以蒸馏水作为空白对比，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光汲取值③测定并计算DNA含量（

g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA

的含量为50g/ml的体内DNA复制与PCR的技术区分：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞供应ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开头复制。复制的方向子链的5’端向3’端延长子链的5’端向3’端延长课堂小结多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延长？3、PCR技术最突出的优点是A原理简洁B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵敏、易于操作从子链的5’端向3’端延长4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A反复洗涤