叶绿素的提取实验报告

叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成及测定生物资源系食卫101韦琪（20102023）指导老师：张倩、刘新梅一、实验目的1.从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率；2.研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件；3.分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率；4.通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。二、实验原理蚕沙是桑蚕的排泄物，由蚕沙制取天然色素——叶绿素酮钠盐，是国外普遍采用的最佳途径。叶绿素是一种酯，因此不溶于水，而溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。叶绿素是植物吸收太阳能进行光合作用的主要色素，叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面．高等植物中含有叶绿素a和叶绿素b分子式如下：蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。 叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：C55H72MgN4O5+2NaOHC34H30O5N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸：C34H30O5N4MgNa2+4H+C34H34O5N4+Mg2++2Na+叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐：C34H34O5N4+Cu2+C34H34O5N4Cu+2H+C34H34O5N4Cu+2NaOHC34H34O5N4CuNa2+2H2O由叶绿素转化成叶绿素铜钠的过程也可用化学反应方程表示：（1）皂化：COOCH3COONaC32H30ON4Mg+2NaOH→C32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OHCOOC20H39COONa（2）酸化：COONaCOOHC32H30ON4Mg+2H2SO4→C32H30ON4H2+MgSO4+NaSO4COONaCOOH（3）铜代：COOHCOOHC32H30ON4H2+CuSO4→C32H30ON4Cu+H2SO4COOHCOOH（4）成盐：COOHCOONaC32H30ON4Cu+2NaOH→C32H30ON4Cu+2H2OCOOHCOONa三、实验仪器和试剂1.仪器：（一个），分液漏斗（2个）,250mL锥形瓶（1个），烧杯（100ml、250mL、500mL）各1个，容量瓶（100mL、250mL）各1个，蒸馏装置，减压过滤装置，玻璃棒，电子天平，圆底烧瓶（250mL）2个，酸度计，分光光度仪（一台）。2.试剂：（50g）、95%乙醇，丙酮，石油醚，2%～5%NaOH乙醇溶液，硫酸铜溶液，无水乙醇，稀盐酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾。四、实验流程 蚕沙——预处理——浸提（三次，分别是3h,1h,1h）——抽滤——浓缩——萃取液皂化——分离——萃取——调PH值——铜化——抽滤——离析——沉淀——烘干——纯化——成盐——过滤——成品五、实验步骤叶绿素原料→极性有机溶剂萃取→过滤→萃取液→皂化→非极性有机溶剂萃取除去脂溶剂性质→叶绿素盐溶液→酸化形成叶绿素酸→→铜代→加氢氧化钠形成叶绿素铜钠→洗涤干燥→检验纯度及质量。（1）蚕沙预先处理：将50g蚕沙放入打磨机中打磨粉碎。（2）从蚕沙中提取叶绿素：加入乙醇-丙酮混合液（1:1）150ml于40~45°C提取3~5h，抽滤，滤渣再用同等体积乙醇-丙酮的混合液提取（3）叶绿素的皂化：合并两次提取液并加5%的NaOH-乙醇水溶液调pH值为11，水浴加热(50-60°c)皂化回流1h左右。皂化目的是为了除去甲基和叶绿基酯基，即向溶液中加入NaOH溶液，在温度为50-60°（4）回收，洗涤：皂化完毕后，蒸馏回收混合液（60°（5）叶绿素酸中的铜代：石油醚下层液用稀盐酸溶液调pH值为7后，加入2-3mlCuSO4溶液，再用稀盐酸将溶液调节pH值为2。在50°（6）洗涤：室温下收集沉淀，先用50~60°（7）溶解成盐：静置4小时后，用抽滤瓶进行抽滤，滤饼用丙酮溶解，再加入5%的NaOH-乙醇溶液pH值为12（相当于100g叶绿素铜酸约加入20gNaOH），皂化回流1小时，成盐（过程是先呈粘稠状，随着NaOH的加入,渐渐变稀,直到pH达到11时又复变稠），可用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐。（8）过滤干燥：静置过滤，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，然后在60°C~80°C下烘箱中烘干结晶物，粉碎即得叶绿素铜钠盐。称量，计算产率。（9）纯度分析：1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线：用电子天平称取标准样品0.0100g，加水溶解。转入10mL容量瓶中定容，摇匀。准确取1mL溶液以pH为7.5的磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液。用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在405nm波长处测定溶液的吸光值A（每隔10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。类似地，配制0.0005%,0.00075%,0.001%，0.005%,0.0075%浓度的溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在405nm波长处测定溶液的吸光值A（每隔10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，绘制标准曲线。2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线：取1中配置好的0.001%的溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在360nm～700nm波长处测定溶液的吸光值A（每隔10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。记录数据,并绘制吸收曲线。3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定：称取烘干成品0.100g（精确至0.0002g），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。从容量瓶中准确取2.00mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0.004%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm。以缓冲溶液为空白液，用分光光度计测定，在350nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），记录数据，绘制吸光曲线。六、注意事项：1.水浴加热时温度控制不宜加热过快；2.减压蒸馏时对压力的要求不能过高；3.保证浸润时间足够、提取完全；4.实验操作的规范及安全问题；5.要调节好溶液中pH值大小；6.实验操作的规范及安全问题。七、试验记录表1实验现象记录试验操作试验现象备注称取干燥粉碎的蚕沙50.00g蚕沙表面灰绿色，粗糙，呈六棱形，粉碎后变成粉末状粉末中不能有过多的颗粒存在加入蒸馏水润湿，再加入95%乙醇，用磁力搅拌器再60度下加热搅拌2h，抽滤，弃去滤渣，保存滤液得到墨绿色滤液和黑色滤渣使用双层滤纸重复回流两次抽滤，弃去滤渣，合并滤液得到墨绿色滤液和黑色滤渣使用双层滤纸把滤液放入旋转蒸发仪，并在55-60℃加热蒸馏回收95^%乙醇得到无色透明的回收乙醇和墨绿色浓缩液烧杯壁上沾哟墨绿色物质在浓缩液5%NaOH-C2H5OH，调节PH=11-12,温度为55℃，皂化时为3溶液的实际pH=11.35，且溶液中有小气泡皂化过程皂化后用石油醚萃取杂质，弃去上层液分层，上层黄绿色，下层绿色除杂除杂后的皂化液加HCl调，PH＝7加入10%CuSO4调PH＝2－3，在搅拌下温度55℃，保持1h加HCl得pH＝7.05加入硫酸铜溶液pH=2.12，溶液中现胶状墨色悬浮物铜代过程静置过滤，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，然后在60°C~80°C下烘箱中烘干结晶物，粉碎即得叶绿素铜钠盐。60℃烘干得0.9578g得墨绿色物质洗涤液呈绿色去离子水呈绿色固体溶解得绿色液体得墨绿色粉末成盐过程称取0.100g叶绿素铜钠溶于蒸馏水配成1%溶液，测其pH值溶液呈教亮的深绿色溶解后用PH=7.5的缓冲液定容表2标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长360370380390400405410吸光度0.2510.2520.2630.2820.3150.3240.326波长420430440450460470480吸光度0.3010.2530.2130.1870.1660.1440.137波长490500510520530540550吸光度0.1250.1170.1180.1120.1070.1010.104波长560570580590600610620吸光度0.0970.1010.0930.0940.1040.0970.098波长630640650660670680690吸光度0.1060.1130.1120.1120.1060.0920.083波长700吸光度0.076表3叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm）溶液百分数（%）0.00050.2110.00100.3240.00150.4920.00200.574

附表一：标准叶绿素铜钠标准曲线附表二：产品叶绿素铜钠吸收曲线产品叶绿素铜钠产品叶绿素铜钠吸收曲线y=181.5x+0.1202500.20.40.60.80.00050.0010.00150.002溶液百分含量吸光度A附表三:405nm波长下叶绿素标准曲线八、实验数据处理（1）所得产品质量m=0.实验用蚕沙质量m=50.00g，故产率为：w=0.03g/50.00gx100%=0.06%（2）产品叶绿素铜钠纯度：当A405nm=0.324,由标准曲线得溶液的百分量，即x=(0.324-0.12025)/181.5=0.1123%.产品纯度：∩=0.1123%/0.06%=1.87（3）A405nm=0.324A630nm=0.034吸光比：A405nm/A630nm=0.324/0.034=9.53九、实验讨论搅拌萃取的时间不足，浸提的时间不足，浸提不够充分。皂化不够充分，虽然皂化的时间比较长，但效果还是不明显，可能是由于皂化时PH值没调节好以及温度没控制好。在旋转蒸发器上蒸馏回收乙醇的时间不足，使得浓缩液中残留过多的乙醇，把叶绿素溶解在其中，不利于后来对叶绿素的提取。在实验过程中加入各种试剂的量控制不是非常精确，调节PH也有偏差，使得提取的叶绿素存在较多的杂质。整个实验过程中洗涤、过滤和转移的次数比较多，使得产品损失较大。叶绿素结晶过程中，由于烘干不够充分，导致晶体中水分较多，产品纯度低。萃取前，应取一些皂化液验证是否皂化完全，如果出现明显分层现象，则说明皂化完全，但我们在实验过程中，虽然进行了多次较长时间的皂化，可还是无法出现明显的分层，初步分析原因应为皂化过程中PH值调节不好。本次实验测得的吸光度值与相对标准的吸收曲线有偏差，原因可能有：（1）所制备的产品纯度较低；（2）产品没有完全烘干。十、实验心得与体会这一次实验在操作过程中出现了一些问题，使得实验存在一些误差，包括人为的操作失误，偶然的误差和系统误差，表现为绘制出来的样品叶绿素铜钠盐吸收曲线最大吸收峰与理论值有所偏差以及产品纯度不高。通过这次实验，我对各种仪器的使用有了更进一步的了解，对基本的实验操作也有了更深刻的认识，学会了独立思考和自己设计实验的能力，学会了怎样设计和操作一个完整的实验。我在这次实验中收获很大，使我受益匪浅。十一、参考文献：[1]曾昭琼．有机化学[M]．北京：高等教育出版社，1997564-565．[2]杨昆山．配位化学[M]．成都：四川大学出版社，1987．270-273．[3]杨继生，何学志，扬州大学化学化工系，叶绿素铜钠盐的性质，制备工艺及应用，广州食品工业科技，2002-(1)-(27)[4]王正平，单旭峰，哈尔滨工程大学化工学院，叶绿素铜钠的制备及稳定