溶菌酶教学讲解课件

Welcome!灰色链霉菌RX-17溶菌酶的研究1.Welcome!1.第一部分：溶菌酶简介一、溶菌酶的发现溶细菌酶（Bacteriolyticenzyme），又称细菌细胞壁水解酶，专门作用于细菌细胞壁的骨架物质—肽聚糖（peptidoglycan）。按对肽聚糖作用位点的差异，溶菌酶可分为作用于聚糖链的N-乙酰胞壁质酶（N-acetyl-muramidase），作用于肽桥的内肽酶（Endopeptidase）以及作用于连接聚糖链与肽桥间酰胺键的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶（N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase2.第一部分：溶菌酶简介一、溶菌酶的发现2.对溶菌酶的研究，是从尼科尔（Nicolle)1907年发现枯草芽孢杆菌溶解因子的报告开始的；两年后，拉希琴科指出鸡卵白有强抑菌作用，是酶作用的结果；1922年，弗莱明发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强的溶菌活性，并把其溶菌作用的因子命名为：溶菌酶。从此便开始了对溶菌酶的研究。3.对溶菌酶的研究，是从尼科尔（Nicolle)1907年发现枯二、溶菌酶的分类1.c型(chicken-type):鸡卵清溶菌酶2.g型(goose-type):鹅卵清溶菌酶3.t型(T4-type):T4噬菌体溶菌酶4.Ch型(Chalarosis-type):

拟内串生孢霉溶菌酶4.二、溶菌酶的分类1.c型(chicken-type):鸡卵清c型：鸡卵清溶菌酶HEWL以鸡卵清溶菌酶为代表的c型溶菌酶，在自然界中占的比重最大，研究和应用也最为广泛，其中HEWL长期以来一直被作为一种“模型”体系，用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系，HEWL的Glu-35、Asp-52被认为是酶催化中心的必须氨基酸，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属于c型5.c型：鸡卵清溶菌酶HEWL以鸡卵清溶菌酶为代表的c型溶菌酶，g型:鹅卵清溶菌酶GEWLGEWL最早由Jolles和Canfield发现，与c型溶菌酶轻度同源，除GEWL之外，g型溶菌酶仅存在于少数几个物种中，如黑天鹅、鸵鸟等，GEWL的Glu-73、Asp-86可能与HEWL的Glu-35、Asp-52同源，参与了酶的催化反应6.g型:鹅卵清溶菌酶GEWLGEWL最早由Jolles和Ct型:细菌噬菌体T4溶菌酶噬菌体溶菌酶存在于很多噬菌体内，参与了“溶解宿主菌”这一生物学过程，其在氨基酸序列上与c型溶菌酶同源性很差，但它们组成的主干、结合底物的定位及催化的特异性方面有很多相似之处，Glu-11和Asp-20被认为是T4L型溶菌酶的催化中心氨基酸。7.t型:细菌噬菌体T4溶菌酶噬菌体溶菌酶存在于很多噬菌体内Ch型:拟内串生孢霉溶菌酶与其它3种类型不同，Ch型溶菌酶除具有ß-1,4-N-乙酰胞壁质酶活力外，还具有ß-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶活力（ß-1,4-N,6-O-diacetylmuramidase），能够作用于N-乙酰胞壁酸6位氧原子乙酰化肽聚糖类型的细菌，如金黄色葡萄球菌（S.au）等，因此Ch型溶菌酶又称为N,O-二乙酰胞壁质酶。对于Ch型溶菌酶研究比较详细的除ChL外，还有来自球孢链霉菌（Strptomycesglobisporus）的M1酶，来自天蓝色链霉菌（S.coelicolor）的Cellosyl，来自丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）的溶菌酶以及肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）噬菌体Cp、乳杆菌（Lactobacillus）噬菌体mv1和φadh产生的溶菌酶。8.Ch型:拟内串生孢霉溶菌酶与其它3种类型不同，Ch型溶菌链霉菌产生的溶菌酶类型1、内-N-乙酰胞壁质酶(endo-N-acetylmuramidase)2、内肽酶(Endopeptidase)3、酰胺酶(Amidase)4、内-N-乙酰氨基葡糖苷酶9.链霉菌产生的溶菌酶类型9.球孢链霉菌及变溶菌素

（Streptomycesglobisporus)(Mutanolysin)1、N-乙酰胞壁质酶M12、N-乙酰胞壁质酶M23、AM3-内肽酶4、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶10.球孢链霉菌及变溶菌素

（Streptomycesglobi白色链霉菌（s.albus)1、G菌株：32酶、F1酶

MA酰胺酶

SA、ML、MR内肽酶2、LA-7菌株:内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶3、Heymer,1975:

内-N-乙酰胞壁质酶11.白色链霉菌（s.albus)1、G菌株：32酶、F1酶1灰色链霉菌（S.griseus)12.灰色链霉菌（S.griseus)12.其他链霉菌红霉素链霉菌（S.erythaeus）光滑（制酵母）链霉菌（S.levoris）墨西菲链霉菌（S.recifensis）吸水链霉菌（S.hygroscopicus）天蓝色链霉菌（S.coelicolor）13.其他链霉菌13.3.溶菌酶的来源人和哺乳动物中的溶菌酶：已知在人的眼泪、鼻粘液、唾液、乳汁等分泌液中及肝、肾、淋巴组织中含有该酶。由130个氨基酸组成，含有四个二硫键。从牛马等乳汁中也已经分离出溶菌酶，性质与人的溶菌酶基本相似植物溶菌酶：木瓜大麦无花果和卷心菜等植物体中已分离到该酶鸡卵清中的溶菌酶：鸡卵清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解G+细菌，但对G-细菌无效。一级结构由129个氨基酸组成。噬菌体产生的溶菌酶：该酶是一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，在未感染的宿主细胞上不存在该酶。14.3.溶菌酶的来源人和哺乳动物中的溶菌酶：已知在人的眼泪、微生物产生的溶菌酶微生物产生的溶菌酶可以分为七类：A.蛋白酶与内肽酶，可分解细胞壁缩氨酸聚糖的缩氨酸键；B.酰胺酶，能切断连接聚糖与缩氨酸的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸键；C.内-N-乙酰己糖胺酶，可分解构成细胞壁骨架的肽聚糖；D.β-1，3、β-1，6-葡聚糖酶，可分解酵母菌细胞壁；E.壳聚糖酶，与葡聚糖酶共同作用，可分解霉菌和酵母；F.磷酸甘露糖酶，与葡甘露糖酶共同作用可分解原生质；G.脱乙酰壳多糖酶，主要分解毛霉和根霉15.微生物产生的溶菌酶微生物产生的溶菌酶可以分为七类：15.第二部分：溶菌酶的作用机理16.第二部分：溶菌酶的作用机理16.G+细菌细胞壁结构17.G+细菌细胞壁结构17.G-细菌细胞壁结构18.G-细菌细胞壁结构18.肽聚糖结构模型图19.肽聚糖结构模型图19.聚糖部分(NAM-NAG)结构示意图20.聚糖部分(NAM-NAG)结构示意图20.二、溶菌酶的作用部位不同细菌细胞壁的结构差异很大，这不仅体现在非聚糖部分，肽聚糖部分也是如此。这些差异造成了一种溶菌酶作用于不同的细菌时溶菌活性的差异.通常认为有三种结构在溶菌过程中起关键作用：一是：肽聚糖中聚糖部分的O-乙酰基：NAM上的6位碳原子上的羟基是否乙酰化对胞壁质酶的活性影响很大。二是：肽聚糖中的短肽结构：短肽的组成与交联程度决定了酶的作用对象。三是：非聚糖部分主要是磷壁酸质、链球菌族的特异性多糖和特异性M蛋白，他们的存在与否决定了酶分子能否与底物结合。21.二、溶菌酶的作用部位不同细菌细胞壁的结构差异很大，这不仅体现第三部分：链霉菌溶菌酶的研究进展链霉菌属是产生抗生素最多的一个属，其产生溶菌酶的研究也受到了微生物学家的重视。1936年Welsch首次分离到产溶菌酶的白色链霉菌(S.albus).该属产生的溶菌酶多属Ch型，溶菌谱较广，因此受到众多学者的青睐。主要有以下几类：一、球孢链霉菌(S.globisporus)及变溶菌素(Mutanolysin)：最早是1972年发现，它能够溶解龋齿的主要致病菌-变链球菌（S.mitans)。共纯化出四种主要成分M1、M2和AM3-内肽酶以及N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。目前Mutanolysin已经商品化生产（Sigma），主要是作为工具酶用于分子生物学方面的工作。22.第三部分：链霉菌溶菌酶的研究进展链霉菌属是产生抗生素最多的一二、白色链霉菌(S.albus).最早是1936年Welsch首次分离到的白色链霉菌(S.albus)G菌株.该菌株能产生十余种作用于细胞壁的溶解酶。其中研究较多的有32酶和F1酶，二者均属于N-O-二乙酰胞壁质酶。其他的还有MA酰胺酶及SA、ML、MR内肽酶。三、灰色链霉菌（S.griseus)研究较多的有S-35菌株、H-402菌株、P-51菌株。S-35菌株产两种溶菌酶一种是N-O-二乙酰胞壁质酶，另一种是内肽酶；H-402菌株产内-N-乙酰胞壁质酶，属C型；P-51菌株溶菌酶仅对铜绿假单胞菌有显著的分解作用。四、其他链霉菌主要有：红霉素链霉菌、光滑链霉菌、墨西菲链霉菌、吸水链霉菌以及天蓝色链霉菌。23.二、白色链霉菌(S.albus).最早是1936年Wels第四部分：N，O-二乙酰胞壁质酶的研究

N，O-二乙酰胞壁质酶的最大特点是能够水解对其他三种类型溶菌酶均呈现非敏感性的S.aureus，也就是这个特点，使其在代替化学制剂作为新型的抗菌、防腐剂方面有很大的优势。因此下面介绍一下该酶的主要性质一.N,O-二乙酰胞壁质酶的生化性质第一个被发现的N,O-二乙酰胞壁质酶是来自霉菌Chalaropsis的Ch酶。理化性质研究表明，该酶是一种中性蛋白质，分子量22，415Da，pI=7.53，能充分分解金黄色葡萄球菌、粪链球菌、白喉棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、溶壁微球菌等菌体，但不能分解革兰氏阴性细菌，其分解S.aureus菌体的最适pH为5.6，分解S.aureus细胞壁的最适pH为4.6，分解S.aureus菌体的最适离子强度在0.01以下，高离子强度会抑制酶的活性。Felch等人对Ch酶的一级结构进行了测定：它由211个氨基酸残基组成，N末端氨基酸为Thr，C末端氨基酸为Gly，分子内有一个二硫键。在所有来源于微生物的胞壁质酶中，Ch酶是第一个被阐明一级结构的酶。氨基酸序列分析表明，它与c型、g型及T4型胞壁质酶均没有序列同源性。24.第四部分：N，O-二乙酰胞壁质酶的研究N，O-二乙酰胞壁质N,O-二乙酰胞壁质酶的分子生物学研究

1990年，Lichenstein等人对S.globisporus的M1酶基因（acm）进行了克隆、测序，发现acm基因以ATG起始子开始，其后为885个核苷酸的开放读码框架，在其翻译的294个氨基酸中，前77个为前导肽区域，负责酶的成熟肽部分穿膜。N端第9-13个氨基酸残基区域为一Arg簇，接下来在14-23位为一疏水区，在24-77位含有很多切割位点，可能是信号肽的切割处。在基因末端的终止密码子TGA下游有一个15bp的反向重复序列，负责acm基因的转录中止。与链霉菌的基因特点相符，acm基因G+C%达到71.4%，且三连密码子的第三位有97.2%的为G或C。25.N,O-二乙酰胞壁质酶的分子生物学研究25.三、N，O-二乙酰胞壁质酶的立体结构分析

Rau等根据对Cellosyl晶体的X射线衍射，构造出了该N,O-二乙酰胞壁质酶的三维结构，如下图一含有8个β-strand，6个α-helix。Cellosyl的催化中心位于β/α折叠桶的底部带大量负电荷的“深洞”中，这与一般的β/α折叠桶结构类似。在桶的底部，形成一个长的凹槽（groove），里面依次排列着酸性氨基酸残基:Asp-9,Asp-98及Glu-100和Asp-198，而Asp-9,Asp-98及Glu-100这些酸性氨基酸被认为是Ch型胞壁质酶的催化位点。图二的Cellosyl电荷分布图也证实了这一点26.三、N，O-二乙酰胞壁质酶的立体结构分析26.第五部分：溶菌酶的应用一.食品工业上的应用1.海产品及水产品的保鲜；2.低度酒的防腐；3.乳制品保鲜；4.干酪的保鲜5.水产熟制品及肉类熟制品的保鲜防腐6.糕点及饮料的防腐7.保健食品添加剂8.婴儿食品添加剂27.第五部分：溶菌酶的应用一.食品工业上的应用27.二、酶工程上的应用溶菌酶已经成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶，用于制造和提取菌体内活性物质如核酸、酶及活性多肽等。M1、M2(EC3.2.1.17)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(EC3.5.1.18)和AM3-内肽酶是从变溶菌素中分离得到的四种主要溶菌酶,并且都已被纯化至电泳纯。M1可用来作为细菌细胞壁结构研究和从细菌细胞壁制备特殊种类的抗原、质粒DNA、天然微生物蛋白和原生质体的有力工具。细菌细胞壁含有很多种生理活性物质,利用M1分解植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和S.mutans细胞壁所得肽聚糖有极强的免疫佐剂活性。所以变溶菌素可以作为从细菌细胞壁选择性地制备生理活性材料的理想制剂。28.二、酶工程上的应用28.三、在医学上的应用第一个方面是：龋病的防治。研究表明，变链球菌是主要的致龋菌，从控制病原微生物方面着手进行生物防龋是当前研究的热点之一。目前，国内外的学者偏向于通过制备变链主要表面抗原AgⅠ/Ⅱ和在牙菌斑形成中十分关键的葡糖基转移酶（GTF）的抗体进行免疫防龋，但该方法在安全性、廉价性等方面存在很多问题，迟迟不能用于实践。而通过溶菌酶直接作用致病菌，从根本上消除致病因素，是该酶在应用中的一大优势。目前已分离出的纯胞壁质酶有望在牙膏、漱口液、口腔含片、口香糖等制剂行业有所发展。

29.三、在医学上的应用29.第二个方面是：对S.aureus等病原菌的控制。S.aureus是人类化脓感染的主要病原菌，据统计大约一半以上的医院内感染都是由此菌引起。目前对葡萄球菌引起的感染主要是进行抗生素治疗，但抗生素的滥用使致病菌的耐药性逐渐增强，人们只能通过寻找更新型的抗生素来解决这个问题。若直接将能够分解S.aureus的Ch型溶菌酶用于治疗和消毒，则会从根本上杀死致病菌，不会产生抗药性的问题。以前用卵清溶菌酶也尝试过这方面的试验，但它对多数葡萄球菌的非敏感性决定了该试验的不可行性。而胞壁质酶对S.aureus的高活性预示着它可能在此方面有所突破。此外，在制备原生质体、提取质粒及染色体DNA、获取细胞壁免疫活性物质、研究细胞壁及细胞膜的结构等方面，该酶也有广阔的应用前景。30.第二个方面是：对S.aureus等病原菌的控制。S.aure第六部分灰色链霉菌RX-17溶菌酶的初步研究

菌株的筛选→→菌株的鉴定→→产酶条件优化→→总溶菌体系性质的研究→→纯组分的分离纯化→→纯组分的性质研究→→酶的应用初步研究31.第六部分灰色链霉菌RX-17溶菌酶的初步研究31.一、产溶菌酶菌株—链霉菌RX-17

的筛选与鉴定菌株的筛选1.添加变链的双层平板2.初筛3.复筛32.一、产溶菌酶菌株—链霉菌RX-17

液体溶菌活性33.液体溶菌活性33.平板溶菌活性34.平板溶菌活性34.溶菌率的测定35.溶菌率的测定35.对几种常见细菌的作用36.对几种常见细菌的作用36.RX-17生长与产酶曲线37.RX-17生长与产酶曲线37.RX-17溶菌酶是非诱导型酶38.RX-17溶菌酶是非诱导型酶38.菌株的鉴定1、形态特征2、培养特征3、生理生化特征4、细胞壁成分分析5、16SrRNA全序列分析39.菌株的鉴定39.形态特征：在高氏合成一号琼脂上，生长良好，用光学显微镜观察，气生菌丝发达，绒粉状，孢子丝链状，直或柔曲，孢子圆形至椭圆形。40.40.培养特征：在这些培养基上气生菌丝多为灰白色至黄色，基内菌丝多为各种色调的黄色，少量出现白色、灰褐色或蓝色，除在马铃薯块、葡萄糖营养琼脂上产生褐色色素外，在其他培养基上基本上不产色素。在高氏合成一号琼脂、马铃薯块上生长良好，气生菌丝茂盛，在酵母膏麦芽膏琼脂、苹果酸钙琼脂上生长适中，而其他培养基均不适合该菌株的生长，气生菌丝稀薄，孢子量少，有的形态似细菌菌落。41.培养特征：41.生理生化特征：42.生理生化特征：42.碳源利用实验43.碳源利用实验43.细胞壁成分分析RX-17全细胞水解液中含有LL-二氨基庚二酸（LL-DAP）、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸五种氨基酸，菌体含有葡萄糖、核糖和木糖三种单糖。据此可推断该菌株为胞壁Ⅰ型，符合链霉菌属的特征。44.细胞壁成分分析44.16SrRNA全序列测定：PCR引物：8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)1512R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)PCR反应条件：97℃预变性7min，加入Taq酶，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，30个循环后延伸10

min。45.16SrRNA全序列测定：45.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳46.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳46.Blast结果：>gi|10038674|dbj|AB045866.1|AB045866Streptomycesgriseussubsp.griseusgenefor16SrRNALength=1485Score=2849bits(1437),Expect=0.0Identities=1447/1449(99%),Gaps=1/1449(0%)Strand=Plus/Plus47.Blast结果：47.培养基组成的优化对碳源、氮源的正交实验：三因素三水平最适配比：蔗糖3%，蛋白胨1.25%，酵母膏0.20%48.培养基组成的优化48.最适培养条件的选择最适培养时间72h最适培养温度33℃培养基最佳初始pH7.5培养基最佳接种量10%摇瓶装液量小于10%49.最适培养条件的选择49.溶菌体系性质的研究--最适温度及热稳定性50.溶菌体系性质的研究--最适温度及热稳定性50.溶菌体系性质的研究--最适作用离子强度51.溶菌体系性质的研究--最适作用离子强度51.溶菌体系性质的研究--最适作用pH及pH稳定性52.溶菌体系性质的研究--最适作用pH及pH稳定性52.溶菌体系性质的研究--金属离子的影响53.溶菌体系性质的研究--金属离子的影响53.溶菌体系性质的研究--化学试剂的影响EDTA-螯合剂-巯基抑制剂-巯基化合物+羰基抑制剂-非离子表面活性剂++离子型表面活性剂SDS-三氯乙酸-54.溶菌体系性质的研究--化学试剂的影响54.溶菌体系性质的研究--溶菌谱55.溶菌体系性质的研究--溶菌谱55.溶菌体系性质的研究--溶菌谱56.溶菌体系性质的研究--溶菌谱56.溶菌体系性质的研究--溶菌谱57.溶菌体系性质的研究--溶菌谱57.溶菌体系性质的研究--溶菌谱58.溶菌体系性质的研究--溶菌谱58.本部分小结

最适培养基组成最适培养条件溶菌体系性质分析

1、最适温度及热稳定性2、最适作用离子强度3、最适pH及PH稳定性4、金属离子和化学试剂的影响5、溶菌谱的研究59.本部分小结59.三、RX-17溶菌酶各组分的

分离纯化及性质研究酶的纯化步骤60.三、RX-17溶菌酶各组分的

各组分的粗分级-CM-Sephadex-C50离子交换层析61.各组分的粗分级-CM-Sephadex-C50离子交换层析6R1组分的纯化62.R1组分的纯化62.R2组分的纯化R3组分的纯化63.R2组分的纯化63.第三部分RX-17溶菌酶各组分的

分离纯化及性质研究R1组分、R2组分的SDS64.第三部分RX-17溶菌酶各组分的

R1组分和R2组分部分性质比较65.R1组分和R2组分部分性质比较65.R1组分和R2组分的其他性质（1）金属离子：Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Pb2+可使二者全部失活，Mg2+可激活R1酶，对R2酶无影响；1mmol/L的EDTA可以使R2大部分失活，而R1还有60%以上的酶活，说明R2的活性更依赖某种金属离子的存在。（2）化学试剂：碘乙酸对R1强烈抑制，巯基乙醇则有部分激活作用，而这两种试剂对R2却基本上没有作用；去垢剂对R1激活作用稍强于R2，1mmol/L的SDS对R1有激活作用，而对R2则有抑制作用。66.R1组分和R2组分的其他性质66.R1组分和R2组分的其他性质（3）溶菌谱从对金黄色葡萄球菌的作用来看，二者均应属于N,O-二乙酰胞壁质酶。总体上看，R2的溶菌谱比R1稍广，二者对乳杆菌、链球菌尤其是变链球菌作用效果较好。而对微球菌活性较低，对芽孢杆菌、大肠杆菌作用的种属特异性及菌株特异性较强，对革兰氏阴性细菌中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌作用尚可，对酵母基本上没有作用。67.R1组分和R2组分的其他性质67.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线68.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线68.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线69.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线69.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线70.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线70.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线71.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线71.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线72.R1组分和R2组分的其他性质（4）溶菌曲线72.四、RX-17溶菌酶应用

的初步研究RX-17溶菌酶在牙膏中应用的可行性分析1、当牙膏加量与酶液量比例高于1：10（g:mL）时，酶活力有较大幅度的下降2、在牙膏浸出液中的确有强烈抑制酶活力的物质73.四、RX-17溶菌酶应用

牙膏的组成（1）摩擦剂（2）表面活性剂和泡沫剂（3）保湿剂（4）增稠剂（5）粘合剂（6）氟化物等74.牙膏的组成74.牙膏组成成分对RX-17溶菌酶活力的影响75.牙膏组成成分对RX-17溶菌酶活力的影响75.非离子型表面活性剂-Triton的“拯救作用”76.非离子型表面活性剂-Triton的“拯救作用”76.改善溶菌酶热稳定性的初步尝试微生物的污染是造成溶菌酶不易保存的重要原因之一，过滤除菌后的酶液保存性能明显优于未除菌组。77.改善溶菌酶热稳定性的初步尝试77.加入各种保护剂、稳定剂、防腐剂、激活剂对酶贮存的效果78.加入各种保护剂、稳定剂、防腐剂、激活剂对酶贮存的效果78.加入各种保护剂、稳定剂、防腐剂、激活剂对酶贮存的效果结果：（1）NaCl和甘油的确对酶的长期贮存十分有益

（2）非离子表面活性剂对酶的活性只起到了激活作用79.加入各种保护剂、稳定剂、防腐剂、激活剂对酶贮存的效果79.第七部分N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达80.第七部分N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因的克隆、序列分析及在大81.81.一、N,O-二乙酰胞壁质酶R2的纯化

及性质研究纯化工艺的改进原工艺:盐析透析CM-C50CM-FF

收率17.9%改进后工艺:盐析透析CM-FF

收率24.1%82.一、N,O-二乙酰胞壁质酶R2的纯化

层析图对比及SDS鉴定83.层析图对比及SDS鉴定83.84.84.85.85.来自大豆蛋白胨的溶菌促进物质

对胞壁质酶R2的激活作用86.来自大豆蛋白胨的溶菌促进物质

对胞壁质酶R2的激活作用86.来自大豆蛋白胨的溶菌促进物质

对胞壁质酶R2的激活作用性质分析:1)煮沸处理:0.5h/1h/2h2)蛋白酶:胃蛋白酶/胰蛋白酶/蛋白酶K3)螯合剂EDTA87.来自大豆蛋白胨的溶菌促进物质

对胞壁质酶R2的激活作用性质分来自大豆蛋白胨的溶菌促进物质

对胞壁质酶R2的激活作用88.来自大豆蛋白胨的溶菌促进物质

对胞壁质酶R2的激活作用88.胞壁质酶R2的紫外吸收光谱89.胞壁质酶R2的紫外吸收光谱89.胞壁质酶R2的氨基酸组成分析90.胞壁质酶R2的氨基酸组成分析90.胞壁质酶R2的N末端氨基酸序列分析步骤：SDS→PVDF膜的预处理→转膜→PVDF

膜漂洗及染色→序列测定仪器：491ProteinSequence(AppliedBiosystem公司)多肽氨基酸序列测定仪

方法：Edman降解法结果：DTSGVQGIDVSHWQG91.胞壁质酶R2的N末端氨基酸序列分析步骤：SDS→P胞壁质酶R2的N末端氨基酸序列分析92.胞壁质酶R2的N末端氨基酸序列分析92.N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因

的克隆与序列分析引物设计：

N端氨基酸序列结果及同源序列

PrimerDesign软件设计结果：PrimerA’:5´-GATAGAATTCGACACCAGCGGTGTCC-3´（EcoRⅠ）PrimerB:5´-GCTCAAGCTTCTCACGCCGTGTTGTT-3´（HindⅢ93.N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因

的克PCR反应PCR扩增条件：

97℃变性7min后开始循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10minPCR扩增结果：94.PCR反应PCR扩增条件：94.95.95.重组质粒pMD18-T-R2的构建96.重组质粒pMD18-T-R2的构建96.重组质粒pMD18-T-R2的鉴定PCR验证97.重组质粒pMD18-T-R2的鉴定PCR验证97.EcoRI、HindIII双酶切验证

98.EcoRI、HindIII双酶切验证

98.胞壁质酶R2基因的序列测定99.胞壁质酶R2基因的序列测定99.胞壁质酶R2基因的同源性分析100.胞壁质酶R2基因的同源性分析100.胞壁质酶R2基因的限制性酶切图谱101.胞壁质酶R2基因的限制性