重组瑞替普酶的高效表达及复性研究

重组瑞替普酶的高效表达及复性研究

复性溶栓药物的展望目前，血栓形成疾病已成为威胁人类健康的主要杀手，发病率很高。这是现代医学领域的研究热点之一。因此，高效化合金药物的开发变得非常紧迫。稀释复性法是一种简单快捷的蛋白质复性方法,也是其他各种复性方法的研究基础。Harris等1材料和方法1.1试剂和仪器重组rt-PA质粒载体为pET-28a,T7启动子,含卡那霉素抗性标记,宿主菌为E.coliBL21(DE3),由本实验室保存。人t-PA标准品购自上海飞轩生物科技有限公司,rt-PA标准品购自德国Boehringer-Ingelheim公司,纤维蛋白原与凝血酶购自美国Sigma公司,二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)购自阿拉丁试剂,蛋白酶抑制剂购自上海罗氏制药有限公司,胰蛋白胨、酵母提取物、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、尿素、卡那霉素、TritonX-100、还原及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)购自上海生工,其余试剂均为国产分析纯。1.2e.colibl21de3菌株的培养将转化了重组质粒pET-28a/rt-PA的E.coliBL21(DE3)菌株以0.1%的比例接种至5mlLB种子培养基(含50μg·ml1.3r-pa的构建发酵液于4℃下6000r·min1.4r-pa包组分的溶解和重叠复性将纯化后包涵体按1:20(质量:体积)的比例用BufferC(100mmol·L1.5复性rt-pa结构分析1.5.1蛋白浓度测定采用SDS待测rt-PA依上述方法操作,将测得的D1.5.3rt-PA结构分析以rt-PA标准品作为对照,采用荧光光谱法分析复性后rt-PA结构变化,激发波长为295nm,发射波长记录范围为280~460nm。2结果与讨论2.1基中振摇培养2.1.1诱导剂浓度的确定将种子液接种于发酵培养基中振摇培养至OD2.1.2培养温度的确定将种子液接种于发酵培养基中摇床培养至OD2.1.3培养时间的确定将种子液接种于发酵培养基中摇床培养至OD2.2sds-东南角分析以上述优化的诱导表达条件对rt-PA进行发酵培养,将破胞液、破胞上清与沉淀、包涵体洗涤液上清与沉淀分别用SDS进行分析,结果见图4。由图可知,破胞液中表达产物主要位于39×102.3不同ph对rt-pa复性过程的影响为了将溶解后的变性蛋白最大程度地重折叠至天然构象,本文采用稀释法对其进行体外复性,使其逐步消除变性因素,恢复生物活性。在蛋白质复性过程中,不同的目标蛋白对复性环境有特定的要求。鉴于rt-PA含有9对二硫键,在完全还原的状态下,其18个自由巯基2.3.1rt-PA复性动力学在蛋白质重折叠过程中,酶活总是伴随着分子空间结构的形成而变化,然而对于富含二硫键蛋白而言,其采用何种方式折叠成具有活性的天然态构象的机理仍有待研究。本文首先在初始条件下(蛋白浓度100μg·ml2.3.2复性pH对rt-PA复性过程的影响配制不同pH(pH=9.0,9.5,10.0,10.5)的BufferD,将脱除DTT的rt-PA包涵体变性液缓慢加入其中,控制蛋白终浓度为100μg·ml2.3.3GSH浓度对rt-PA复性过程的影响在其余组分不变的情况下,将BufferD中的GSH浓度分别改变为0.5、1、2、4和8mmol·L2.3.4GSH/GSSG比例对rt-PA复性过程的影响将BufferD中GSH/GSSG比例分别调节为1、2、4、8和16,其他条件不变,复性24h。GSH/GSSG比例对rt-PA稀释复性的影响如图8所示。由图可知,当GSH/GSSG比例位于4~16这一较宽的范围内时,复性后蛋白活性均较高,并在比例为8时达到最大值。这是因为,富含二硫键的蛋白对复性体系中的氧化还原环境要求更为苛刻。GSH/GSSG比例越高,复性体系的还原能力就越强,但过高的比例不仅不利于二硫键形成,且会减慢二硫键的形成速率;相反,GSH/GSSG比例越低,复性体系的氧化能力就越强,二硫键形成速率和蛋白质折叠速率都会加快,但过低的比例将导致二硫键错配概率增加,造成没有活性的蛋白和聚集体的增多,此外强氧化性环境也不利于错配二硫键进行异构以形成有活性的蛋白质2.3.5蛋白浓度对rt-PA稀释复性的影响将rt-PA包涵体变性液(初始蛋白浓度2mg·ml2.4复性条件的正交实验为缩短复性后蛋白的纯化流程,降低生产成本,更好地适应工业化的需求,在初步确定了复性液pH、GSH浓度以及GSH/GSSG比例为复性过程中关键因素的情况下,本文进一步设计了3因素3水平的正交实验为了避免由于局部蛋白浓度过高引发的聚集沉淀,本研究采用流加操作直观分析结果表明,各复性条件的最佳组合为A2.5复性rt-pa的荧光光谱分析蛋白质的荧光光谱能提供rt-PA中色氨酸残基周围微环境的变化信息,从而反映其复性过程中结构上的变化。当rt-PA分子在295nm处被激发时,得到的即为色氨酸的发射光谱,变性及复性后的rt-PA荧光光谱分析结果如图10所示。在体外复性过程中,当变性的rt-PA重折叠为天然态时,裸露于溶液中的色氨酸残基逐渐包埋于分子内部疏水区域,其所处的微环境极性降低,从而引起最大发射波长λ3复性过程的优化本文对重组瑞替普酶(rt-PA)包涵体的制备及体外复性过程进行了较为详尽的研究,确定了最优的表达条件以及影响rt-PA体外复性过程的重要参数,并通过正交实验设计对高浓度下rt-PA的体外复性过程进行了优化。本文研究结果表明,通过对复性过程的优化,采用稀释复性法处理如rt-PA等富含二硫键的蛋白是切实可行的,并且可以获得较高的比活,而高蛋白浓度下体外复性由于折叠过程中大量疏水基团的暴露导致产生大量的聚集沉淀,不可避免地面临收率降低的问题。在工业生产过程中,可适当提高pH与氧化还