克氏原螯虾源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及其16srdna序列分析

克氏原螯虾源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及其16srdna序列分析

元宝虾具有很高的经济价值，是中国重要的水产资源。它在全国各地，尤其是长江以南的长江以南。据统计,全国对克氏原螯虾的年消费量高达几万吨,具有十分广阔的养殖前景。自20世纪90年代克氏原螯虾人工养殖在江苏等地首次获得成功后,安徽、江苏、湖北、江西、河南、浙江、湖南、天津、山东、四川、广东、福建、贵州、重庆、广西、陕西等省市均不同程度地开展了克氏原螯虾的养殖1材料和方法1.1感染虾的来源患病克氏原螯虾,体长约为(5—7)cm,取自上海天亿克氏原螯虾养殖基地。1.2致病菌的分离用75%酒精对具有典型发病症状的濒死克氏原螯虾进行体表消毒,然后在无菌条件下取其肝胰腺、肌肉等组织以及头胸部的积液,分别在TCBS和普通营养琼脂平板上进行致病菌株的分离,并将平板在30℃恒温培养18—24h后进行菌株的纯化,在斜面琼脂培养基上进行转接培养后于4℃冰箱保存备用。1.3培养基上各菌株菌悬液的制备选取健康的克氏原螯虾进行人工回归感染实验。先将培养基琼脂斜面上的各菌株的菌苔分别用无菌生理盐水洗下,经稀释涂布平板法测定浓度后再用无菌生理盐水调节各菌悬液浓度为1.0×101.4pcr扩增条件及测序生理生化鉴定参照王会聪等分子鉴定以致病菌株的基因组DNA为模板,选用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对其16SrDNA进行PCR扩增。PCR的扩增条件为:94℃3min;94℃1min,60℃1min,72℃1min,共35个循环;72℃延伸10min。PCR产物的纯化与测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站中的BLASTn软件,将致病菌株的16SrDNA序列与GenBank基因库中已知细菌的16SrDNA序列进行同源性比较后,进一步通过软件Mega4.0对同源性较高的16SrDNA序列进行多重比较,并利用邻接法构建致病菌株的系统发育树。1.5致病菌生长曲线测定致病菌株液体菌种的制备将致病菌株接种到斜面培养基上30℃培养18h后接种到pH7的100mL无菌营养肉汤中,于30℃、200r/min条件下摇床振荡培养18h后即为液体菌种。生长因子对致病菌生长的影响取液体菌种1mL接种到100mL无菌营养肉汤中,分别于不同pH(3、5、7、9、11)、温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)、转速(100、150、200、250、300r/min)条件下摇床振荡培养18h后取样,测定各条件下致病菌株的A双氟沙星对致病菌生长的影响取液体菌种1mL分别接种到含双氟沙星0、6.5、12.5、25、50、100μg/mL的100mLpH5的无菌营养肉汤中,于30℃、200r/min条件下振荡培养18h后取样,测定各双氟沙星浓度下致病菌株的A致病菌生长曲线的测定将液体菌种1mL接种到100mLpH5的无菌营养肉汤中,于30℃、200r/min条件下摇床振荡培养,分别在0、0.5h、1.5h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h分别取样测定致病菌株的A2结果2.1疾病的分离从自然发病克氏原螯虾的肝胰腺、肌肉、积液中分别分离纯化到2株、3株、1株优势细菌,分别暂名为L2.2消毒疾病的评估菌株L2.3致病菌生长特性pH对致病菌生长的影响实验结果表明(图2),豚鼠气单胞菌L温度对致病菌生长的影响实验结果表明(图3),豚鼠气单胞菌L转速对致病菌生长的影响实验结果表明(图4),豚鼠气单胞菌L双氟沙星对致病菌生长的影响实验结果表明(图5),豚鼠气单胞菌L致病菌的生长曲线实验结果表明(图6),0—1.5h为生长延迟期,1.5—24h为对数生长期,24—36h为稳定期,36h以后为衰亡期。3发酵菌株的生长特性豚鼠气单胞菌是水产养殖动物常见致病菌,可危害中华鳖(Triongxsinensis)、丰产鲫[CarassiusauratusofPenze(♀)×Cyprinusacutidorsalis(♂)]、鲤(CyprinuscarpioL.)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)、南方鲇(SilurusmeriordinalisChen)、胡子鲶(Clariasfuscus)、杂交鲟([Husohuso(♀)×Acipenserruthenus(♂)]、中国对虾(Penaeuschinensis)、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)等多种水产养殖动物豚鼠气单胞菌的生化特性具有菌株差异性。本实验分离的豚鼠