脊髓损伤修复的研究进展

脊髓损伤修复的研究进展

脊柱损伤被认为是一种不可治愈的疾病，但近年来的病理生理研究加深了对脊柱损伤修复因素的理解，细胞生物学和生物学的发展为脊柱损伤的治疗提供了新的手段，希望对脊柱损伤进行治疗。其中，细胞移植和基因治疗是两种最具前景的方法，也是当前研究的重点和方向。一、髓突生长的治疗脊髓损伤后的修复面临许多问题,主要是损伤后脊髓中的环境不利于修复的发生和发展,如:(1)脊髓神经元的死亡和缺乏修复能力;(2)促进修复的因素如神经营养因子的缺乏;(3)存在抑制修复的分子如NOGO、髓磷脂相关糖蛋白等;(4)胶质瘢痕、空洞阻碍轴突生长。脊髓损伤修复的策略就是针对这些因素加以干预:减少受损细胞的变性和损失,细胞移植补充受损细胞;补充神经营养因子;减少抑制性因子;减少瘢痕和空洞,提供轴突生长的基质。从脊髓损伤治疗的策略来看,完全恢复脊髓功能非常困难而且并非必要,治疗的目的应该是恢复对生活质量有重要作用的那一部分功能。各种脊髓损伤治疗措施实现的难易程度有很大不同,从易到难依次为:再髓鞘化、残存神经元的轴突再生、神经营养因子的表达和释放、神经元再生、轴突出芽和形成合适的突触、远距离的轴突再生并精确连接到靶器官。目前来看最可能先达到的目标可能是使变性但是没有断裂的轴突重新形成髓鞘恢复其功能,如果能够恢复10%的功能性轴突连接就可以支持行走。所以研究优先考虑的重点应该是髓鞘形成和轴突再生,而细胞移植和神经营养因子的基因治疗就是达到这种目的的主要手段。二、神经细胞移植细胞移植可在脊髓损伤的多个方面起作用,如替代受损细胞如神经元和少突胶质细胞,分泌促进再生的神经营养因子,保护神经元减轻继发损伤,在脊髓损伤空洞区形成桥接引导神经再生,酶解胶质瘢痕,去除细胞碎片,调节免疫反应,修复脊髓中的非神经组织如血管等。目前可供选择的细胞类型有胚胎干细胞(ES)、神经干细胞(NSC)、嗅鞘细胞(OEC)、雪旺细胞(Schwanncell)、成纤维细胞(Fibroblast)、骨髓间充质干细胞(BMSC)、巨噬细胞(Macrophage)等。胚胎干细胞有多向分化能力,McDonald用4-/4+RA方案诱导的ES向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化,可以使培养的细胞中90%以上为少突胶质细胞。移植后细胞在脊髓空洞中生长、增殖并向远处迁移,分化为少突胶质细胞(60%)、神经元(10%)和星形胶质细胞(30%),表达髓磷脂、髓磷脂碱性蛋白和细胞外基质成分纤维连接素和层粘连蛋白,使得轴突髓鞘形成,提高运动功能。通过体细胞核转移技术,将来有可能培养出带有患者自身染色体的ES细胞,解决目前存在的ES细胞来源和免疫排斥反应等问题。神经干细胞成体动物脊髓内存在神经干(前体)细胞,而且在损伤后可以激活和增殖,但是不足以完成修复过程,需要补充外源性神经干细胞。NSC移植后主要分化成为胶质细胞引导髓鞘形成,部分分化成为神经元形成突触连接。有少部分分化为少突胶质细胞,形成髓鞘,主要是外周型髓鞘,集中在损伤部位。在和正常区域交接的部位新生的髓鞘终止延长,所以不会干扰正常的轴突功能。我们用NSC移植到损伤脊髓后,发现NSC可以存活,减小脊髓空洞,提高运动功能。嗅鞘细胞起源于嗅基底膜,分布在嗅球、嗅神经并可伴随嗅束迁徙入脑。它不同于星形细胞和雪旺氏细胞,但同时具有这两种细胞的特性,它存在并迁徙于周围神经和中枢神经之间,可以穿越外周神经/中枢神经屏障。在整个中枢神经系统通路中,它包被嗅神经轴突,以防止它们与其他中枢神经系统细胞接触。OEC能分泌大量不同种类的神经营养和支持因子如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等,在其膜上表达出很多与细胞黏合和轴突生长相关的分子和促进神经生长因素的分子如L1、PSA-N-CAM、N-CAM、laminin、fibronectin。OEC可以自体取材移植,当嗅鞘细胞被移植入成年鼠的脊髓损伤区内,它们能与宿主神经实体组织结合为一体,抑制瘢痕和空洞的形成,帮助再生神经轴突穿过抑制屏障如胶质组织,并随再生神经轴突迁徙到特殊靶点。在神经脱髓鞘的情况下,嗅鞘细胞能帮助神经髓鞘化和加速神经电生理传导速度。和雪旺细胞移植相比,OEC能和星形胶质细胞很好的整合,不引起星形胶质细胞的肥大和表达硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的上调,减少星形胶质细胞反应性增生和蛋白多糖的表达,促进运动刺激电位恢复的能力更强。雪旺细胞,脊髓损伤特别是有硬脊膜破裂后有雪旺细胞迁移到脊髓中,但是一般形成“雪旺细胞瘤”,没有形成髓鞘。雪旺细胞移植后,可以在脊髓中形成髓鞘,这种髓鞘和脊髓本身的有区别,含有大的细胞核和细胞质,有基膜和细胞外胶原沉积,雪旺细胞移植后脊髓的传导速度加快,引导轴突通过移植细胞并且长入远端脊髓中。雪旺细胞能自体取材和大量扩增,能够使髓鞘再生,但是它和星形胶质细胞的相互作用阻碍了其在脊髓损伤修复中的作用。到达星形胶质细胞的边界后雪旺细胞停止生长和迁移,能够引导轴突长入,但是不能使轴突穿越移植物到达远端脊髓。加用咯利普兰(rolipram)和双丁酰环腺苷酸(db-cAMP)后,移植的雪旺细胞增加了损伤部位的轴突数量并且使其穿越损伤部位达到远端脊髓,增加了神经元数量和髓磷脂含量,可使脊髓挫伤成年大鼠恢复70%的正常行走功能。骨髓间充质干细胞是一种成体干细胞,能诱导成为神经元和胶质细胞,能分泌神经营养因子、细胞因子和其他生物活性因子。我们的实验发现BMSC能分泌BDNF和NGF,移植到脊髓后能减轻细胞凋亡,减少脊髓空洞,促进运动功能的恢复。BMSC注射到脱髓鞘的SCI模型中,能促进髓鞘形成,主要为表现为周围型髓鞘,但有少部分(3%)形成的髓鞘和少突胶质细胞类似。成纤维细胞主要是作为基因的载体细胞,它本身也可以表达支持神经元和轴突的细胞外基质如纤维连接素等,有容易培养和转染基因的优点。其他如巨噬细胞移植后能吞噬变性的轴突和髓磷脂,减小脊髓空洞,分泌BDNF等因子,促进运动功能恢复。三、mds-gf在髓中的常用模型神经营养因子在促进脊髓损伤恢复中起重要作用,可以保护神经细胞减少其损失,促进髓鞘形成和轴突再生。脊髓损伤进行细胞移植治疗后,局部和移植的细胞既可以分泌多种促进神经损伤恢复的神经营养因子,又产生抑制轴突生长的分子,这两种相互对抗的因子处于平衡状态,所以神经再生是有限的,要进一步促进神经的再生需要额外补充有促进作用的神经营养因子。目前临床主要通过静脉注射某些神经营养因子,但由于神经营养因子是生物大分子,难以通过血脑屏障,而且全身使用效率低。通过微泵在局部使用可以提高效率,但是使用不方便且不能长期使用。基因治疗可将神经营养因子基因导入体内,在局部长期产生神经营养因子,具有局部浓度高、分泌的时间、空间可调控等优点。基因治疗包括invivo和exvixo等方式,exvixo同时具有细胞移植的基因治疗的双重优点。将目标基因导入到细胞有物理化学方法(如阳离子脂质体等)和生物方法。用阳离子脂质体等可以直接将基因转到体内(invivo),但是转染的效率低,基因的表达是暂时的。病毒载体是主要的发展方向,现在常用的病毒载体有单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)载体。单纯疱疹病毒载体的优点是具有神经亲合性,在神经元内可以长时间潜伏,载体容量大,可以从注射部位逆向运输到神经元。缺点是对除了感觉神经元外的其他神经元转染效率低,瞬时表达,有一定的毒力。腺病毒载体可以携带多种神经营养因子基因有效地转染神经元和胶质细胞,但是它也是瞬时表达,也有一定的毒力。腺相关病毒载体的蛋白编码序列被完全去除,因此克服了AdV和HSV的免疫原性和神经毒性。慢病毒载体最先源于HIV,属于逆转录病毒载体,可以转染分裂细胞和非分裂细胞,基因插入染色体稳定表达,维持高表达时间长答6个月以上,免疫原性小,但是有导致染色体插入诱变的可能。NGF是最早发现的神经营养因子,主要作用于感觉、交感神经。分泌NGF的成纤维细胞移植到脊髓后,可以引起脊髓初级感觉传入神经轴突、局部运动神经轴突、蓝斑核脊髓轴突的出芽,但是皮质脊髓束轴突没有变化。出芽的轴突可以生长到移植细胞内,但是不能穿越到达远端脊髓组织。Neurotrophin-3(NT-3)是在脊髓中作用最强的神经营养因子。NT-3转染成纤维细胞移植到慢性脊髓损伤模型中,可以显著地促进皮质脊髓束的再生,长度达到15mm,促进脊髓运动功能恢复。NT-3转染少突胶质细胞的前体细胞后可以使其向少突胶质细胞分化,分泌髓鞘碱性蛋白的数量增加,并在共培养的神经元周围形成髓鞘。BDNF可调节神经元的生长和存活,主要作用于红核脊髓束和红核神经元,能促进脊髓损伤后红核脊髓束的再生和功能恢复。BDNF可以抑制神经元内磷酸二酯酶的活性,通过Erk依赖的途径提高细胞内cAMP,增强轴突生长能力,并且能够克服轴突延长的抑制物MAG的作用。GDNF能促进运动、感觉轴突生长,引导雪旺细胞迁移到损伤脊髓并使新生的轴突形成髓鞘。转染GDNF后,移植的OEC在脊髓内增加红核脊髓束和皮质脊髓束的轴突再生,促进运动功能恢复。转基因细胞移植可以促进和引导轴突长入,但是轴突较少穿越移植物进入到远端脊髓中,这种现象可能和神经营养因子的持续分泌有关。所以需要控制神经营养因子的表达,上调表达使轴突长入移植物中,然后当轴突即将穿越移植物时下调基因表达,使轴突穿过移植物长入远端脊髓组织中。比如使用有四环素启动子载体转染神经营养因子,让动物服用含强力霉素使导入体内的基因表达下调。四、细胞移植和基因治疗综上所述,细胞移植和基因治疗是脊髓损伤治疗的重要手段,在动物实验中取得了好的效果,有很好的临床应用前景。但是目前的研究还需要进一步的深入,如在细胞移植治疗方面还需要研究:胚胎干细胞和神经干细胞移植前的定向分化调控;对多种细胞移植的效果进行比较,挑选疗效最佳的细胞类型;移植的时机和途径的选择;是否能将胶质细胞和神经元按比例共同移植以提高疗效等等。在基因治疗方面还需要研究:基因治疗的安全性问题;基因表达的时间、空间调控;多种因子的协调和序贯作用等。目前细胞移植和基因治疗的效果还比较局限,将来还需要综合其他多种治疗方法取得更好的效果,如抑制继发损伤、中和抑制性分子、电刺激和功能锻炼等。现在的研究多是在小动物如大鼠、小鼠、猫等上进行的,由于小动物和人类在脊髓损伤后的病理