衣藻不运动突变体if79的基因克隆与分析

衣藻不运动突变体if79的基因克隆与分析

例如，高度保守的细胞通常存在于真核生物细胞中，这与信号转导和动物发育密切相关。正确监测和维持雇主的组装、凝聚力、定制和保存。缺点往往导致一些疾病。在人体中，滥用职权的劣势包括多囊肾病（pmd）和肾原毛（pcd）引起的各种疾病。IFT复合体高度保守且由两个亚复合体组成,分别为IFT-A和IFT-B.IFT-B复合体的核心蛋白包括IFT70、IFT46、IFT88、IFT81、FT74/72、IFT52、IFT22、IFT25及IFT27IFT-B复合体与鞭毛内的正向运输紧密相关,相关蛋白缺陷常常造成鞭毛组装障碍,如IFT46或者IFT88缺陷引起的短鞭毛或无鞭毛突变单细胞真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)作为一种模式生物,常用于研究鞭毛组装和解聚的机制.然而,莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白IFT81参与调控鞭毛组装尚未见突变体分析.本文通过插入突变的方法,筛选出了不运动突变体ift81,序列分析发现是IFT81基因缺陷.对该突变体的分析显示IFT81基因缺陷导致衣藻鞭毛变短或丧失,进一步的蛋白定位和显微结构观察证实IFT81蛋白在鞭毛组装过程中具有重要功能,这为揭示IFT81蛋白调控鞭毛组装机理提供了基础数据.1材料和方法1.1抗体主题材料野生型莱茵衣藻株21gr(mt+)(CC-1690)购自美国明尼苏达大学衣藻中心.抗体anti-α-tubulin(1∶2500)购自美国Sigma公司.抗体ratanti-HA(1∶4000)购自瑞士Roche公司.抗体mouseantiIFT81(1∶1000)由UniversityofIdaho的Dr.Cole惠赠.1.2细胞培养条件衣藻细胞培养于液体培养基,培养温度为23~24℃.培养条件为:R液体培养基连续光培养S/0代(即直接从平板上挑取并转移到液体培养基培养的细胞),3~5d后转接至M液体培养基1.3突变体安全性评估原理按照Liang和Pan将线性化的外源片段aphⅧ(巴龙霉素抗性基因)导入野生型莱茵衣藻细胞中,从众多转化子中筛选获得运动缺陷突变体,应用限制性内切酶定点扩增PCR(restrictionenzymesite-directedamplificationPCR,RESDA-PCR)鉴定外源片段在突变体衣藻基因组中的插入位置通过PCR方式从野生型衣藻基因组DNA中克隆5.5kb的含有完整IFT81基因(不包括终止密码子)和IFT81基因的内源性启动子(1.3kb)的片段,再将一个与终止子相连的3×HA(haemagglutinin,血凝素)蛋白标签加在5.5kb的基因序列之后,最后选择一个含有潮霉素(HygromycinB)抗性基因的表达载体1.4聚丙烯酸凝胶电泳和蛋白质免疫印花聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验采用Wang等1.5荧光和荧光试验采用Wang等2结果与讨论2.1突变体鞭毛的形态为获得衣藻不运动突变体,通过电转化的方式将外源DNA片段aphⅧ导入野生型衣藻21gr细胞之中.从3000个转化子中,筛选获得运动缺陷突变体7个,将其中的一株不运动突变体命名为af13-24.野生型21gr细胞,有两个等长的鞭毛,其长度大约是12μm,见图1(a).与野生型细胞不同,大部分突变体细胞在细胞分裂完成后不能正常分开,在液体培养基中细胞呈现出聚团生长的现象.在这些细胞团中,可以明显观察到短鞭毛的存在,见图1(b).经过细胞壁溶解酶处理,突变体细胞可以从细胞团中分散开,单个的突变体细胞呈现出无鞭毛或者短鞭毛的多种性状,图1(c)~(f).为了进一步分析突变体鞭毛的长度特征,用细胞壁溶解酶处理获得分散的突变体细胞后统计鞭毛的长度分布,见图1(g).在所有突变体细胞中,无鞭毛的细胞占57%左右,鞭毛长度0~1μm的细胞大约有20%,鞭毛长度1~2μm的细胞有17%左右,鞭毛长度2~3μm的细胞约为4.5%,鞭毛长度3~4μm的细胞少于1.5%.与突变体不同的是,野生型21gr细胞的两根等长的鞭毛主要分布于11~14μm之间,70%左右细胞的鞭毛都在11~14μm;只有很少的细胞鞭毛长度是小于11μm或者大于14μm.这些结果显示,不运动突变体衣藻af13-24是一种短鞭毛或鞭毛缺失突变.2.2突变体af13-24的aft81基因缺陷为了确定突变基因,将突变体基因组的RESDAPCR产物与pMD19-T载体连接并测序,测序结果与莱茵衣藻基因组(V4版本)进行比对.结果显示,突变体的IFT81基因被外源基因破坏.IFT81基因有13个外显子,其编码序列包括2052个碱基对,共编码683个氨基酸,突变体的第五个外显子中插入了外源基因aphⅧ,并且其中有52个碱基对被置换,见图2(a).因此,突变体af13-24被重新命名为ift81.用WesternBlot检测内源IFT81蛋白的结果显示,IFT81蛋白在野生型细胞中正常表达,而在突变体细胞中检测不到,见图2(c),该结果与测序结果一致.为进一步确认IFT81基因缺陷是引起突变体性状的原因,构建了含有完整IFT81基因的互补载体,见图2(b),并将环形互补质粒导入突变体ift81细胞之中.从90个转化株中筛选得到三个性状恢复为野生型的回复突变体,在这三株回复突变体中都可以检测到IFT81-HA融合蛋白的表达,见图2(d),其中的ift81∷IFT81-HA1#回复突变体被用于做后续实验.另外,利用IFT81蛋白的特异抗体,也可以在回复突变株中成功检测到IFT81-HA融合蛋白的表达,见图2(e).2.3胞鞭毛的突变体结构电镜技术被用于进一步观察突变体ift81细胞鞭毛的微观结构.将固定后的细胞切片,利用透射电镜可以清晰地观察到衣藻鞭毛的显微结构,见图3.可以看出,野生型细胞鞭毛的横切面展示出典型的“9+2”轴丝结构(图3(a1)),在过渡区有一个“H”型的结构(图3(a3)),其纵切面则展示出了鞭毛内的IFT粒子(图3(a2)).突变体ift81细胞鞭毛的横切面展现“9+2”轴丝结构(图3(b1)),鞭毛过渡区的“H”结构与野生型相比有差异(图3(b4)).短鞭毛的纵切面展示出有完整鞭毛膜包被的轴丝,但是在部分短鞭毛的顶端出现了轴丝紊乱现象(图3(b2)~(b4)).2.4回复突变体中ha荧光信号的分布确定鞭毛内运输蛋白IFT81的定位是研究鞭毛组装机理的基础.回复突变体表达了IFT81-HA融合蛋白,因此选用α-tubulin(微管蛋白)抗体(红色,对照)和HA抗体(绿色),并利用免疫荧光实验检测.可以看出,HA荧光信号在野生型细胞(21gr)中检测不到,但同等条件下,回复突变体中的HA荧光信号(绿色)集中于基体部位,鞭毛上也有点状的荧光信号分布,见图4.这些结果表明IFT81蛋白主要定位于基体,少量以点状形式沿着鞭毛分布.2.5突变体鞭毛的基因缺失引起的突变体鞭毛组装体依赖于鞭毛内运输机制,野生型衣藻可以在每个细胞周期完成后生成两根等长的鞭毛(11~14μm).然而,缺乏完整IFT81基因的突变体ift81却不能形成鞭毛或者只能组装成两根很短的鞭毛.突变体ift81的基因结构分析表明,外源基因aphⅧ整合到了IFT81基因的第五个外显子之中,并且替换了其中的52个碱基对.蛋白免疫印迹分析表明,IFT81蛋白在野生型细胞中可以正常表达,而在突变体细胞中则没有正常表达.导入完整IFT81基因后,突变体鞭毛的性状又得以恢复为正常,说明该突变体的表型确实是由于IFT81基因的缺失导致的.IFT81是非常保守的蛋白,在人类RPE-1细胞中利用RNAi技术抑制IFT81会使得长有纤毛的细胞数量大大降低2.6ift81和ift钢质分子模块在竹材运输过程中的作用鞭毛和纤毛在生物的生命活动中都扮演着重要的角色.在鞭毛生长的过程中,新的轴丝蛋白会添加在轴丝的顶端,使得鞭毛不断生长.因为鞭毛内部缺乏合成蛋白的相关机制,只能在细胞体内合成鞭毛相关蛋白再运输到鞭毛内部完成组装,这就是鞭毛内运输机制(IFT机制).IFT是一种双向运输系统,正向的运输与IFT-B复合体有关,而反向的运输主要与IFT-A复合体相关.在鞭毛组装过程中,相关前体蛋白不断地从胞体聚集到鞭毛的基部,与IFT复合体结合之后再进入鞭毛内,并在鞭毛的顶端完成组装.另外,在鞭毛长度的维持过程中,IFT系统对相关物质的输入和输出也是必要的根据文献报道,IFT-B复合体的核心蛋白包含一个小的四聚体,该四聚体由两个IFT74/72和两个IFT81蛋白组成在莱茵衣藻突变体ift81中,插入的外源片段破坏了IFT81基因,导致严重的鞭毛组装缺陷.缺陷鞭毛的显微结构表明,无鞭毛和短鞭毛突变体ift81细胞在微观结构也发生变化.通过对突变体插入位点的序列分析,我们发现外源片段并没有破坏IFT81基因中与微管蛋白结合的部分,而是引起与微管结合保守位点之后的序列紊乱.这很可能使得IFT81蛋白的翻译提前终止,从而缺失了与IFT74结合的卷曲螺旋区域,进而导致细胞内无法形成完整的IFT-B复合体.因此我们推测,突变体不能形成正常的鞭毛可能是:IFT8