高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响,等首先把农杆菌介导法应用于真菌的遗传转化,以真菌的分生孢子和菌丝为受体,告成地将转入泡盛曲霉、哈茨木霉、粗糙脉胞菌和双孢菇中[1];等利用提升的农杆菌介导法对双孢菇子实体进行转化并获得告成[2];2022年,等同样用农杆菌转化了双孢菇的菌丝体和担孢子萌发菌丝,获得了稳定的转化子[3];但上述方法中转化效率相对较低,获得的转化子大片面不稳定。

在传统的基因枪遗传转化方法中,大量植物及外植体在轰击转化前经渗透处理都有助于提高转化效率[47],因此,山东省应用微生物重点测验室通过对平菇菌丝体进行高渗处理以及与农杆菌共培育时间等条件的探究,筛选出平菇菌丝体转化的最正确条件。

本文格式为版,下载可任意编辑—2—菌株-2由山东省农业科学院万鲁长老师赠送;根癌农杆菌105菌株由中国农业高校张力群老师惠赠;含有潮霉素抗性基因的质粒1302由山东省应用微生物重点测验室保存。

:马铃薯200,葡萄糖15,琼脂15。

选择培育基:培育基中参加不同浓度的潮霉素公司。

液体培育基:胰蛋白胨10,10,酵母提取物5,~。

固体培育基:液体培育基中参加15琼脂。

本文格式为版,下载可任意编辑—4—诱导培育基:液体培育基中参加乙酰丁香***,溶于二***亚砜中,工作浓度为200μ。

共培育诱导培育基:葡萄糖5;2;47;;;;;2;琼脂20;~。

使用前参加溶于二***亚砜的,工作浓度为200μ。

℃培育5进行活化,然后分别接种于含有50、60、70、80、90、100、200μ潮霉素的平板,以不含潮霉素的平板为对比,置于28℃恒温培育箱培育,每天查看菌丝生特长境,以筛选中添加潮霉素的适合浓度。

任艳,等:[8],将菌液涂于平板上含有100μ卡那霉素,28℃倒置培育,2后挑取农杆菌单菌落,接种于5液体培育基中,200、28℃过夜培育。

次日,按1%的接种量将过夜培育的菌液接种到崭新的诱导培育基中,28℃培育5~6至~。

本文格式为版,下载可任意编辑—4—,25℃培育5,选择菌落边缘生长平匀的菌丝,,为变更细胞内外渗透压,山梨醇等体积混合液中。

将与混合液的作用时间设20、40、603个处理。

处理完毕后将菌丝体外观的水分用无菌滤纸充分吸干。

,,28℃、150进行共培育,时间设20、40、603个处理,每处理设3次重复。

,28℃培育2,然后向其中倒入一层约15的选择培育基,28℃持续培育,每天查看菌丝生特长境,实时挑取新生菌丝为制止重复,每个平菇菌块挑取一次,并再次转接到选择培育基平板上,连续培育7,正常生长的平菇菌丝体为转化子,统计各处理组转化子数量。

用统计软件进行数据分析。

,下载可任意编辑—6—转化子在普遍平板上连续转接15代后再接入到选择培育基平板上,查看菌丝生长状况,与普遍平板上菌丝生长全都的是可稳定遗传的转化子。

[9,10]的方法提取3个抗性稳定的转化子总,以其为模板,以:3’:5’3’为引物由上海生工生物工程有限公司合成扩增中潮霉素抗性基因,以非转化子为阴性对比,以质粒1302为阳性对比。

回响体系为:,缓冲液,,,10μ,2。

回响条件为:94℃预变性4;94℃变性1,58℃复性1,72℃延迟2,35个循环;72℃延迟10。

%琼脂糖进行凝胶电泳检测,凝胶成像系统照相。

。

潮霉素抗性基因的制备:以1302质粒为模板,和作为引物,扩增潮霉素抗性基因,然后回收纯化产物用以制备探针。

本文格式为版,下载可任意编辑—6—突变体基因组酶切电泳:以限制性内切酶酶解质粒1302为阳性对比,以原始菌株为阴性对比,利用酶切平菇转化子和非转化子的总基因组,%琼脂糖在20电压下电泳过夜。

从凝胶中转移至尼龙膜的步骤依据文献[11]的方法进行。

基因片段探针标记,膜的预杂交、杂交、洗膜、显色等步骤均按公司说明书进行。

,潮霉素对平菇菌丝体的生长速度有较大影响,当浓度为30μ时,菌丝生长缓慢;当浓度为50、70μ时,菌丝生长受到抑制;当浓度为100、200μ时,菌丝中断生长。

为了降低转化子的假阳性率,在平菇转化测验中,选取200μ潮霉素作为选择培育基的筛选浓度。

,结果见表1。

本文格式为版,下载可任意编辑—7—9个处理中,1、2菌丝体与农杆菌的共培育时间少于60,农杆菌未能与菌丝体进行充分有效的结合,转化子数量较少;4、5中,由于菌丝体预处理时间较长,虽然与农杆菌作用时间缺乏60,但在渗透压作用下转化子数量较多;7、8、9由于菌丝体处理时间过长,导致细胞发生不成恢复性死亡,转化子数量最少。

3与6得到的转化子数量最多,两者之间无差异,但是3的总用时80比试验6的100短,所以3为最正确转化条件。

表1高渗处理和共培育时间对转化子数目的影响1编号高渗处理菌丝体时间,下载可任意编辑—8—;大小写英文字母表示;,,因此这些转化子都是可稳定遗传的。

,从10个稳定遗传的转化子中选取的3个转化子,第2~4泳道,而以未转化的原始菌株为模板扩增,没有条带消失第1泳道,初步证明基因插入到转化子染色体基因组内。

本文格式为版,下载可任意编辑—9—,3个转化子样品中均产生了杂交带第3~5泳道,而阴性对比非转化子未产生任何杂交信号第1泳道,阳性对比质粒产生了与探针杂交信号带第2泳道,这证明白基因已整合到转化子基因组中。

泳道:分子量标记;泳道1:阴性对比非转化子;泳道2~4:平菇转化子;泳道5:阳性对比质粒:;1:;2~4:;5::阴性对比非转化子;2:阳性对比质粒;3~5:平菇转化子1:;2:;3~5:,下载可任意编辑—10—本试验讨论结果表明,当平菇菌丝体高渗处理20、与农杆菌共培育60时,转化效率高且用时较少,为根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的最佳转化条件。

本讨论中平菇菌丝体的高渗处理和与农杆菌共培育是关键步骤,这可能是由于高渗处理后细胞内形状成压力差,细胞发生质壁分别,液泡变小,此时再与充分诱导的农杆菌混合,能有效的促使农杆菌吸附在细胞表面,并借助此压差更易转入到平菇菌丝细胞