生物制药工艺学课件公开课一等奖课件省赛课获奖课件

生

物

制

药

工

艺

学

生物制药工艺学

主讲教师：吴梧桐专家

第1页《生物制药工艺学》主要参照书

1．吴梧桐主编《生物制药工艺学》第二版，北京，中国医药科技出版社，2023.2．王志军主编《生物技术药品研究开发和质量控制》，北京，科学出版社，2023.3．吴剑波《微生物制药》，北京，化学出版社，2023.

杂志期刊：1.中国抗生素杂志.2.药品生物技术.3.中国生物工程学报.4.中国生化药品杂志.5.中国天然药品.6.中国医药工业.第2页生物制药工艺学Biopharmaceuticalprocess

一、学习本课程目标：1、培养自己掌握扎实专业知识，具有创新、创业能力高素质人才，按联合国科教文组织对世界大学生要求：（1）Learntoknow.(2)Learntodo.(3)Learntobe.(4)Learntotogether.2、培养自己成为药品研究、生产、流通、应用与管理专门人才。为人民防病、治病、保健、康复提供疗效好，副作用少，价格便宜，使用方便生物药品。第3页二、本课程性质：是生物技术、生物工程、海洋药学、生化制药、微生物制药、、生物技术制药专业必修课，也是药学专业主要选修课。三、本课程研究内容是从事各类生物药品研究，生产和制剂工艺过程一门综合性应用技术科学。（1）生化与微生物药品制造工艺。（2）生物技术药品与生物制品制造工艺。（3）其他生物医药产品（康复保健品）制造工艺。四、学习任务与要求：（1）掌握制造工艺基本原理及有关基础理论。（2）纯熟制造技术过程及制剂技术。（3）熟悉生物药品起源、构造、性质及临床用途。第4页第一章生物药品概述

IntroductionofBiopharmaceutics

1．药品

Medicine(remedy)药品是用于预防、治疗或诊断疾病与调整机体生理功能、促进康复促健物质，有4大类：（1）预防药品：如疫苗、卡介苗、艾滋病疫苗、SARS疫苗、肿瘤疫苗。（2）治疗药品：如抗生素、INS、尿激酶。（3）诊断药品：如肝肾功能检查试剂盒、免疫诊断试剂盒。（4）康复保健药品：如维生素、氨基酸、叶酸。第5页2．药品Drug直接用于临床药品制剂产品，是特殊商品。药品特点：有固定组成，明确要求有适应症、使用方法与用量，疗程，并说明也许存在毒副反应。还要求使用有效期。药品有3大类：（1）化学药品，（2）生物药品，（3）中药（药材，饮片，中成药）。

第6页

生物药品Biopharmaceutics

是以生物材料（生物体、生物组织或其成份：组织、细胞、细胞器、细胞成份、代谢物、排泄物）为原料，综合应用生物学、物理化学与当代药学原理与办法加工制成药品。一般有5类：（1）生化药品Biochemicalmedicine（2）微生物药品Microbialmedicine（3）海洋药品Marinemedicine（4）生物制品Biologics(biologicals)（5）生物医药产品Biologicalmedicinalproducts第7页伴随生物技术药品迅速发展，当代生物药品已形成4大类：（1）重组DNA药品（包括基因工程和蛋白质工程药品）（2）基因药品geneticmedicine（核实类药品，以遗传物质DNA、RNA为治疗物质基础药品），如核实疫苗、反义药品。（3）天然生物药品（4）合成或半合成药品。第8页第一节生物药品研究与发展前景一、生物药品研究发展现状生物药品发展已走过传统生物制药技术和工业化生物制药时代，从1982年10月rhIns上市，正式步入当代生物制药阶段。1、世界现状：已上市200多种生物技术药品，已进入Ⅲ其临床400种；其中200种进入FDA审批，尚有700多种进入Ⅰ-Ⅱ期临床，在各个不一样临床前研究有2600多种。第9页二、生物药品发展与展望1．生物技术药品研究已进入蛋白质工程药品时代第一代重组药品时代：一级构造与功能和天然活性蛋白质完全同样；第二代重组药品时代：对天然产物体现物进行简单修饰，如PEG化或糖基化；第三代重组药品时代：蛋白质工程药品，在DNA水平上，合理设计、改造、创制新型治疗蛋白。目标：（1）提升活性；（2）减少或消除毒副作用；（3）提升体内外稳定性；（4）产生新功能特性。如：迅速Ins，B9-Ser→B9-Asp,B27-Thr→B27-Glu长期有效Ins,B21-Asn→B21-Gly,B-C末端加入2个ArgPI由pH5.4→pH6.8第10页2.中国现状：（1）生产生化药品100多种，抗生素近100种；（2）已同意生物技术药品30多种：如INF-α1b,INF-α2a,INFα2b,INF-γ,IL-2,IL2-ser125,IL-11,G25F,GM-CSF,γ-SK，γGH，EPO，TPO，EGF，EGF衍生物，bFGF，Ins，TNF衍生物，脑钠素，心钠素，抗IL-8单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，CHO乙肝疫苗，痢疾疫苗，WuT3单抗（抗CD3CMAb，抗肾移植排斥），131I-chTNT人鼠嵌合型单抗（治肺癌），P53腺病毒抗癌注射剂，葡激酶等，已进入临床有SARS疫苗，禽流感疫苗，艾滋病疫苗。中国生物制药公司近代生物制药公司通过GMP厂家已近200家，年产值400多亿元，仅占全国医药产值7.5%发展空间可观（美国400多亿美元/年），已开始进入自主创新阶段。如：（1）γ-bFGF(全球首家上市)；（2）思凯通（注射SK，1997年上市）；（3）注射用重组葡激酶（2023年上市）；（4）今又生Gendicine（P53腺病毒注射剂）；（5）TNF衍生物第11页2.哺乳动物细胞体现产物所占比重迅速增加2023年已同意创新生物技术药品：酵母体现产品2种，E.coli体现产品4种，分子量均在3.5KDa~6KDa,表达它体现多肽有优势，而通过动物细胞体现系统22种（包括抗体、酶、凝血因子）如：TNKase(t-pA突变体)；（58KDa）；AlsuraZyme（laromidase）(58KDa治疗粘多糖病)Fabrazyme（Algasidasebeta,100KDa,治疗Fabry’s病）3.治疗性抗体发展迅猛FDA已同意17种治疗性抗体，在抗肿瘤、治疗风湿性关节炎，避免感染、抗血小板凝集等方面疗效突出。在369种进入临床试验生物技术药品中有75种是抗体类产品，估计2023年会有17种上市。如抗TNFα嵌合抗体，TNFα-R-Fc融合蛋白。抗体人源化分为（1）嵌合抗体：用人源抗体恒定区替代鼠源抗体恒定区，保存抗体可变区。(2)人源化抗体:可变区中仅CDR（轻链可变区）为鼠源，其FR及恒定区均来自人源。第12页4、干涉RNA（RNAi）RNAinterference，是细胞内外源性或内源性双链RNA，可引发与其同源mRNA特异性减少，抑制基因体现，是抗病毒、抗肿瘤治疗剂主要设计方向。5、基因治疗剂：DNA疫苗与基因药品发展迅速，将功能基因与体现载体重组，导入人体细胞，使其在体内体现活性蛋白，产生免疫或治疗作用。已研究成功乳腺癌DNA疫苗（也许对病毒性肿瘤均可取得成功），尚有黑色瘤基因治疗也取得突破（使病人晚期肿瘤消失），将病人T-cell分离出来，用肿瘤抗原受体基因改造T-cell，再注入人体，能够对黑色素瘤产生有效清除作用。第13页

第二节

生物药品性质与类别一、生物药品特性（CharacterizationofBiopharmaceutics）（一）生物学特性：1、组成、构造与天然活性物质一致，是生物进化与自然选择成果。2、具有调整、控制生物功能，战胜疾病物质基础。3、对人体进行补充、调整、增强、抑制，替代或纠正代谢失调更为合理和有效。4、活性强，毒副作用一般较少，针对性强，疗效确切，尚有营养作用。5、是创新药品优良先导物，通过度子设计能够研制新型有效药品，如从抑长素研制环己肽（环6肽）。28肽———环6肽

Pro-Phe-D-TrpPe-Thr-Lys第14页(二)、化学特性：（1）含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高；（2）组成构造复杂，具严格空间构造，才有生物活性。对多种物理、化学、生物学原因不稳定，故研究时要执行GLP规范，生产时要求GMP管理。（3）活性高，有效剂量小，对制品有效性，安全性要严格要求（包括标准品制定）。第15页二、生物药品类别：共分4大类（一）天然生物药品1．微生物药品microbilmedicine由微生物产生生理活性物质：包括初级及次级代谢产物和转化产物。（1）抗生素：抗菌、抗肿瘤抗生素，如青霉素，链霉素，红霉素，四环素，多粘菌素，两性霉素B，氯霉素，利福霉素，磷霉素等。（2）酶抑制剂：如克拉维酸，β-内酰胺酶抑制剂(青霉素增效剂)（3）免疫抑制剂:如环孢霉素A第16页2．生化药品（含海洋药品）：Biochemicalmedicine用生物化学原理与技术从动植物、海洋生物和微生物制取生化活性物质。（1）氨基酸类药品aminoAcid如胱AA、色氨酸、精氨酸等。（2）多肽类药品Polypeptide如缩宫素、加压素等。（3）蛋白质类药品如人血白蛋白，r-球蛋白（4）酶类药品如胃蛋白酶，尿激酶（5）辅酶类药品如CoQ10,CoASH（6）核苷酸与核酸类药品如RNA注射液：PolyI:C（7）多糖类药品（polysaccharide）:如肝素、玻璃酸。（8）脂类药品：如去氢胆酸，胆红素、PGE1、PGE2。第17页

（二）生物技术药品（新生物制品）Biotech-drugs1.DNA重组药品（DNArecombinantmedicine）－基因工程与蛋白质工程药品（1）细胞因子干扰素类药品:IFNα,IFN-β,IFNγ（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子:IL-2,IL-6,IL-11;TNF-,TNF-R（3）造血系统生长因子类：G-CSF,GM-CSF,EPO,TPO,SCF（4）重组蛋白和多肽类激素药品：Ins，rHGH,FSH,LH,HCG（5）生长因子类药品:EGF，PDGE，TGFα，NGF（6）心血管病治疗剂与酶制剂:水蛭素，t-PA，尿激酶，门冬酰胺酶（7）重组蛋白疫苗与基因工程治疗性抗体：乙肝疫苗、丙肝疫苗、对淋巴瘤CD3单抗（OKT3）抗排斥。HER-2（表皮生长因子受体抗体），抗乳腺癌转移（人源化抗体）第18页2.基因药物（核酸类药物）(1)核酸疫苗：将目基因与表达载体构建成重组体导入人体，使其表达免疫蛋白，呈递免疫应答，如乳腺癌疫苗。(2)反义药物ISIS2900，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎。（三）合成或半合成生物药物：如催产素，降钙素，PEG-腺苷脱氨酶，PEG-门冬酰胺酶第19页第二章生物制药工艺技术基础

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

第一节微生物制药工艺技术基础

一、菌种选育与保芷1．自然选育是一种纯种选育办法，根据自发突变原理，通过不停分离筛选，除去衰变型菌落，选择高产菌，达成强化、复壮、稳定生产目标。操作：单孢子悬浮液→分离及单菌落培养→筛选纯培养：从一种单细胞微生物取得后裔培养称纯培养办法：（1）平板划线法（2）稀释平板法第20页2．诱变育种

（1）诱变处理：①化学诱变；②物理诱变

（2）代谢调整选育

（3）基因重组技术变化代谢途径

（4）原生质体融合

突变株筛选一般进程如图所示

第三第四轮同第二轮第21页3．菌种保存

（1）保存目：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法（4）菌种保芷方法：①斜面低温保存4℃，湿度<70%，细菌可保存1月，放线菌2月，酵母4～6月；②液体石蜡封芷法121℃×30mm灭菌，干燥，封管；③甘油冷冻法；④冷冻干燥法；⑤液氮保藏法第22页二、发酵工程技术基础

发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目物。

1．液体培养——深层发酵

2．固体培养——浅盘培养

发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备，以L-Lys生产设备为例，见图1所示。

第23页图1L-Lys生产过程工艺设备图

第24页第二节生物药品提取、分布、纯化技术基础一、生物材料选择：1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质2．生物材料采集与质控（1）品种判定；（2）避免污染与感染；（3）选择富集目标物材料；（4）冷冻保存第25页

二、生物活性物质提取，浓缩与干燥

1．提取办法与优化

（1）溶剂选择

（2）添加剂①保护剂；②酶抑制剂

（3）提取条件①温度；②pH；③盐；④表面活性剂

HLB值可供选择表面活性剂

（一般10～20为佳）

优化：通过多因子、正交试验设计工艺条件

第26页2．浓缩与干燥

（1）浓缩办法：①盐析；②有机溶剂沉淀；③超滤；④真空浓缩或薄膜浓缩；

⑤离心冻干

第27页（2）干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥

第28页第29页三、分离纯化办法：含量低、易变性、步骤多、多维组合，逐层分离（1）粗品分离：盐析，分级沉淀，萃取，超滤（2）分离纯化：多种色谱层析法（3）精制：亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦四、分离纯化原理：1．根据分子极性与溶解度大小2．根据分子形状与分子大小3．根据电荷差异4．根据吸附特性5．根据生物配基特性第30页第三节生物技术药品制造技术基础

Basisofbiotechdrugpharmaceuticaltechnolog一、基因工程制药技术基础（一）重组DNA技术基本原理基因工程是通过体外重组将甲生物基因转入乙受体生物内进行体现生物技术，包括6个主要过程：（1）取得目标基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）目标基因克隆与判定；（5）目标基因扩增与目标蛋白体现。（6）目标蛋白纯化与制剂第31页

2．基因工程药品制造过程

第32页转化获得目基因→构建重组体→构建工程菌（或细胞）→克隆与鉴定

Upstream→扩大工程菌培养（或细胞）→纯化目蛋白→除菌过滤→半成品检定→制剂→成品检定→包装

Downstream第33页二、基因工程制药主要操作技术

（二）基因工程制药操作技术1．目标基因取得（1）逆转录法：真核基因转录hmRNA在原核不能直接体现（隐具有内函子），在原核中缺乏hmRNA后加工系统，故不能成为成熟hmRNA,故要先纯化目标mRNA，再通过逆转录作用下合成SSDNA(SiglestranDNA)。①cDNA第一链合成:以目标mRNA为模板（3’-poly…AAA）,以oliger-dT为引物，加入dNTP,在逆转录酶作用下合成SSDNA(SiglestranDNA).②cDNA第二链合成:先用碱或RNaseH水解除去与SSDNA配正确mRNA得到cDNA第一链，作为合成cDNA第二链模板，在DNA聚合Ⅰ（klenow片断）作用下，加入dNTP,从5’→3’合成带有发夹构造U型DNA，以核酸酶S1切除U型构造，形成双链DNAdsDNA(cDNA)。第34页图5目标基因取得第35页（2）通过PCR技术制备目标基因PCR（polymerosechainreaction）典型反应包括①模板变性94℃以上（1～2′）(使DNA拆为单链)②退火50～55℃（1～2′）(使引物与模板配对)③延伸72℃（1～2′）由高温聚合酶催化从5’→3’延伸链长。一般可通过30次循环，合成一定量cDNA,错误率一般为0.25%。(扩增>105倍)已有高温DNA聚合酶，故操作已自动化（PCR仪）（3）化学合成法在已知DNA序列或多肽一般构造时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。第36页2．DNA重组体构建将目标基因与基因载体连接，组成重组体基因载体（Vector）有（1）E.coli载体如PBR322（非体现型载体）体现型：PUC质粒，PKK233-3，PET系统：PET28a，PET32（2）芽孢杆菌载体如PUB110pE194和pC194（3）链霉菌载体如PIJ101PSG5（4）λ噬菌体载体如λgt10(非体现型)λgt11(体现型)*非体现型用于构建克隆基因扩增与判定，体现型用于构建生产目标蛋白工程菌。一般目标基因<10Kb，可选用质粒为基因载体，目标基因>10Kb，可选用λ噬菌体DNA为载体。第37页cDNA与载体连接办法

同聚尾连接法

用3’-脱氧核苷末端转移酶，使cDNA与载体DNA3’末端带上互补同型多聚体序列：

如质粒-poly-C（或A）

cDNA-poly-G(或T)二者退火后，经T4DNA连接酶封口，构建重组体。3’脱氧核苷转移酶cDNAcDNA-polyA(C)dNTP载体DNA-polyT(G)②人工接头连接法用T4DNA连接酶在平端上连接上人工接头，再用工具酶切开成粘性末端。目基因 +cDNA接头工具酶（内限性内切酶）第38页3．重组体体现系统体现方式常用有①胞浆内体现②分泌体现③周质体现

（1）原核体现系统①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌StreptomycesE.coli体现系统长处：①易大量生产，成本低，②周期短，相对较安全，已公认可供大量生产。缺陷：①多为胞内体现、纯化困难，②易生成包括体，复性困难，③产物多为AuG(Met)起始密码，④有内毒素污染也许。第39页（2）真核体现系统1）酵母属单细胞真核生物非分泌型载体如PA815,PPIc2,分泌型PHIL-S1长处：①易培养②无毒性③可分泌体现④产物可糖基化常用酵母体现体系①酿酒酵母（Saccharomycescoeviviae）体现，②毕赤酵母（pichiapsatoris）特点：①启动子为AOX1,属乙醇氧化酶I基因,受甲醇诱导②易高密度发酵,达100g/L(10%)已成功用于体现INFα,乙肝表面抗原疫苗,Ins,Aibumin2）动物细胞体现体系A哺乳动物细胞CHO(病毒质粒为载体)B昆虫细胞——家蚕细胞,如生产INFα第40页4．体现与体现产物纯化（1）选择高效体现工程菌，优化发酵条件（培养基组成，接种量，温度，溶氧，pH，诱导作用，发酵动力学）进行扩大发酵.（2）分离纯化要求：①技术条件要温和②选择性要高③收率要高④步骤要少，时间短E纯度>95%。第41页体现产物流程

*inclusionbodies由体现产物重组蛋白,宿主蛋白和膜蛋白组成，以体现产物为主，其一级构造正确，但空间构造错误，没有活性，不溶于水，可低速离心搜集包涵体，用变性剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。第42页为避免或减少包括体形成常用办法：（1）减少培养温度从37℃降到30℃可显著减少包括体形成率。（2）以硫氧还原蛋白为载体进行融合体现。硫氧还原蛋白是E.coil一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目标蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，体现产物聚集于粘附区，通过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目标蛋白。第43页二、酶工程制药技术基础1、什么是酶工程（1）酶发觉，分离，纯化与酶制剂工业化应用。（2）酶与细胞固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）酶工程技术工业化应用。2、长处（1）固定化稳定性提升（2）可反复使用，提升使用效率，减少成本（3）提升强度，便于连续化，自动化，规模化生产（4）便于产物分离、纯化第44页3、制备办法：吸附法，包埋法、共价键结合法、交联法（1）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺如用卡拉胶固定L-苹果酸合成酶生产L-苹果酸，卡拉胶加水（加热）溶解成5%（冷却40℃）加入产酶菌体（搅拌均匀）冷却（冷冻）切块（1-2CM2）KCl固化装柱（2）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合，一般纯酶固定化，用此法适用批量小，附加值高产品生产。如用CNBr活化纤维素载体再与酶蛋白共价结合。利用固定化胰蛋白酶亲和层析制备胰蛋白酶抑制剂（3）交联法：用双功能试剂，将酶与载体交联固定化如用二醛和明胶交联固定化前列腺素合成酶合成PGE1，PGE2第45页

4固定化酶性质：（1）通过固定化酶活一般下降，因酶空间构造发生变化，或酶与底物结合时有空间位阻，因此要测定固定化酶体现活力，再计算总活力，并与使用半衰期延长时间，统计分析固定化工艺有效性（2）提升稳定性，因固定化酶体现活力下降，但稳定性提升，因此其稳定性和测定对评价工艺效益十分主要，半衰期t1/2=0.693KDKD=2.303lg(ED)/(E)为起始活力，[E]为时间t后残留活力。故经常要研究E操作，储存稳定性或对pH对热稳定性和对蛋白酶稳定性。通过E一般能够提升稳定性（包括对温度，pH，蛋白酶，变性剂和抑制剂耐受程度）因此有利工业化连续化与自动化应用。因此在生物工艺中就得到广泛应用。如制造r-氨基丁酸，天冬氨酸，L-苹果酸，丙氨酸，色氨酸，苯丙氨酸等。还用于从丙烯氰生产丙烯酰胺第46页

第四节生物制药工艺中试放大设计

一、中试放大目标与规模

1．目标：（1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供应临床前与临床研究；

（2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，确保能在后来生产中应用。

二、规模：

中试是由小试转入工业化生产过渡性研究，是取得成功产业化关键。

第47页三、中试放大特点1、改善小试操作，稳定工艺2、提升收率，提升产品质量3、减少消耗，确定原辅料质控标准4、形成批量生产，制定制造规程和检定规程四、中试放大时应具有条件（1）有稳定工艺：收率，质量可靠（2）操作条件基本确立（3）已建立中间品和成品分析办法（4）生物材料已判定（5）物料平衡、三废处理已基本处理（6）中试规模、产品产量，规模已确定（7）安全生产已有方案第48页五．中试放大要处理问题（1）原辅材料规格（2）设备选型与材质选用（3）反应条件（4）原辅料中间品、产品质控标准与检定办法（5）下游工艺优化与稳定制造规程制定六