第04章 蛋白质的共价结构

第04章蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构

网络教程第04章蛋白质的共价结构章节目录一、蛋白质通论二、肽三、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能五、肽和蛋白质的人工合成第04章蛋白质的共价结构（一）蛋白质的化学组成和分类化学组成：碳50%

氢7%

氧23%

硫0~3%

其他微量蛋白质的平均含氮量为16%蛋白质含量=蛋白质×6.25胰凝乳蛋白酶

胶原蛋白一、蛋白质通论第04章蛋白质的共价结构按组成分：单纯蛋白；缀合蛋白按生物学功能分：酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白蛋白质发分类单纯蛋白：清蛋白；球蛋白；谷蛋白；组蛋白；硬蛋白等缀合蛋白：糖蛋白；脂蛋白；核蛋白；磷蛋白；金属蛋白；血红素蛋白等第04章蛋白质的共价结构

蛋白质根据性质和溶解度可分为1

纤维状蛋白质结构蛋白，大部分不溶于水胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白2

球状蛋白质功能蛋白，大部分溶于水各种酶、血红蛋白等3

膜蛋白结构与功能蛋白，存在于膜上蛋白质表面存在疏水残基，能与磷脂分子结合（疏水作用）

蛋白质的形状和大小第04章蛋白质的共价结构核糖核酸酶5700病毒外壳蛋白血红蛋白

64500蛋白质的形状和大小第04章蛋白质的共价结构基本结构：一级（1o）结构多肽链的氨基酸序列二级（2o）结构多肽链借助氢键排列成自己特有的α螺旋和β折叠股片段三级（3o）结构多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象四级（4o）结构指寡聚蛋白质中个亚基之间在空间上的相互关系和结合方式一级结构决定高级结构，高级结构决定蛋白质的功能蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次第04章蛋白质的共价结构ABα-螺旋Cβ-折叠股A.α-螺旋和β-折叠股B.核糖核酸酶C.血红蛋白第04章蛋白质的共价结构蛋白质生物学功能：催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、支架作用、防御和进攻、异常功能一级结构二级结构三级结构四级结构氨基酸顺序α螺旋多肽链寡聚蛋白血红蛋白结构蛋白质功能的多样性第04章蛋白质的共价结构（一）肽和肽键的结构加水分解脱水缩合

氨基酸脱水缩合成肽肽键二、肽第04章蛋白质的共价结构丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-甘氨酰-亮氨酰氨基端（N

端）羧基端（C

端）肽和肽键的结构第04章蛋白质的共价结构肽单位构型N-末端C-末端第04章蛋白质的共价结构肽平面处于稳定的伸展构象肽平面处于一种不稳定的构象多肽主链在构象上受到很大限制第04章蛋白质的共价结构NCC

HNC

肽键虽是单键却具有局部双键性质O肽键周边六个原子在同一平面上前后两个氨基酸的α-碳在对角

(trans)Csp2sp2肽键的特性第04章蛋白质的共价结构以单键表示肽键以共振杂化形式表示肽键(反式)以双键表示肽键肽的C-N键略短：共振杂化限制绕肽键自由旋转肽键具有部分双键性形成肽平面肽键存在永久偶极

肽键共振杂化意义：肽键以共振杂化形式存在第04章蛋白质的共价结构

HCCNCOp轨道电子共振使肽键具双键特性第04章蛋白质的共价结构SNH2GlyLeuProCysAsnGlnIleCysTyrSSNH2GlyArgProCysAsnGlnPheCysTyrSArgPheProSerPheGlyProArgPro牛催产素牛加压素舒缓激肽

一些肽类激素的结构天然存在的活性肽(1)第04章蛋白质的共价结构COOHCHNH2CH2CH2CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2SHαβγ谷氨酸半胱氨酸甘氨酸G-SH+HS-G2H2HG-S-S-G谷胱甘肽

G-SH细胞内重要的还原剂天然存在的活性肽(2)第04章蛋白质的共价结构一般测定步骤：

（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目

（2）拆分蛋白质分子的多肽链

（3）断裂多肽链内的二硫桥

（4）分析每一多肽链的氨基酸组成

（5）分析多肽链的N-末端和C-末端残基（6）多肽链断裂成肽段（7）测定各个肽段的氨基酸序列（8）重建完整多肽链的一级结构（9）确定半胱氨基酸残基间形成的S－S交联桥的位置

一、蛋白质测序的策略

测定蛋白质一级结构、样品均一、纯度97%以上、已知分子量1953

年英国剑桥大学SangerF.报告了牛胰岛素两条多肽链的氨基酸序列。三、蛋白质一级结构的测定第04章蛋白质的共价结构1、N-末端分析待分析的DNP-氨基酸可用纸层析、薄层层析或HPLC进行分离鉴定和定量测定DNP-NHAa1Aa2Aa3……AanDNFB+NH2Aa1Aa2Aa3……Aan弱碱pH8~9DNP-Aa1+Aa2+Aa3+……+AanH+水解（1）二硝基氟苯（DNFB或FDNB）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(1)第04章蛋白质的共价结构2．丹磺酰氯（DNS）法是二甲氨基萘磺酰氯的简称。

原理：与DNFB相同

优点：DNS具强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，水解后直接可用纸电泳或薄层层析加以鉴定。N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(2)第04章蛋白质的共价结构（3）苯异硫氰酸酯（PITC）法N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(3)第04章蛋白质的共价结构（4）氨肽酶法性质：肽链外切酶（又称：外切酶）。从多肽链的N-端逐个地向里切

常用的是：亮氨酸氨肽酶（LAP）

PITC+NH2-Aa1Aa2Aa3……AanPTC-NHAa1Aa2Aa3……Aan水解PTH-Aa1+Aa2Aa3……Aan待分析的氨基酸可用薄层层析、气相色谱和HPLC进行鉴定此方法还可以用来测定氨基酸序列N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(4)第04章蛋白质的共价结构OOH2N-CH-C-NHNH2+…+H2N-CH-C-NHNH2+H2N-CH-COOHR1R（n-1）RnRnR(n-1)OH2N-CH-C-NH-…-C-NH-CH-C-NH-CH-R1无水NH2NH2100℃COOHOO2、C-末端分析（1）肼解法(n-1)

个氨基酸酰肼C-末端氨基酸N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(5)第04章蛋白质的共价结构（2）还原法：肽链C-末端氨基酸

↓硼氢化锂

α－氨基醇

↓层析法（3）羧肽酶法：最常用的测C-末端残基方法

性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降解，释放出游离氨基酸。N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(6)第04章蛋白质的共价结构二硫键的断裂第04章蛋白质的共价结构

胰蛋白酶切割3次生成4个肽段溴化氰切割2次生成3个肽段

Glu为N-末端残基氨基酸组成的分析多肽第04章蛋白质的共价结构待测定蛋白质作为抗原产生抗体多核糖体mRNAcDNA氨基酸序列mRNAProtein分离反转录测序推断免疫处理破碎沉淀氨基酸序列（蛋白质）DNA序列（基因）用互补DNA法推断蛋白质的氨基酸序列第04章蛋白质的共价结构

1

酶裂解法（1）胰蛋白酶专一性强、只断裂赖氨酸、精氨酸的羧基参与形成的肽键（2）糜蛋白酶专一性不如胰蛋白酶，断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基所形成的肽键（3）嗜热菌蛋白酶专一性差，断裂较短的多肽链或大肽段（4）胃蛋白酶专一性与糜蛋白酶类似，要求被断裂键两侧的殘基都是疏水性氨基酸（5）木瓜蛋白酶专一性差，断裂位点与其附近的序列关系密切，它对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化第04章蛋白质的共价结构（1）用溴化氰断裂化学裂解法(1)第04章蛋白质的共价结构（2）用羟胺断裂（3）肽段的分离提纯凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC化学裂解法(2)第04章蛋白质的共价结构1.Edman

化学降解法第一步偶联反应第二步环断裂反应第三步转化反应肽段氨基酸序列的测定第04章蛋白质的共价结构借助重叠肽确定肽段在原多肽链中的次序肽段在多肽链中次序的决定第04章蛋白质的共价结构牛胰岛素A链B链核糖核酸酶A序列蛋白质序列举例第04章蛋白质的共价结构根据细胞色素c序列的物种差异建立的进化树四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能第04章蛋白质的共价结构肽液相合成X常用苄氧甲酰基Y常用叔丁酯肽链延伸方向激活参与肽键形成的羧基，现多用更温和的叠氮、混合酸酐和活化酯法。五、肽和蛋白质的人工合成第04章蛋白质的共价结构H2N挂接去保护缩合释放活化保护肽液相合成第04章蛋白质的共价结构小结（1）蛋白质分子是由一条或多条多肽链构成的生物大分子。多肽链是由氨基酸通过共价键共价连接而成的，各种多肽链都有自己特定的氨基酸序列。蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的，而氨基酸序列是由遗传物质DNA的核苷酸序列规定的。肽键是连接多肽链主链中氨基酸残基的共价键，二硫键是使多肽链之间交联或使多肽链内成环的共价键测定蛋白质一级结构的策略

（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目

（2）拆分蛋白质分子的多肽链

（3）断裂多肽链内的二硫桥

（4）分析每一多肽链的氨基酸组成

（5）分析多肽链的N-末端和C-末端残基（6）多肽链断裂成肽段（7）测定各个肽段的氨基酸序列（8）重建完整多肽链的一级结构（9）确定半胱氨基酸残基间形成的S－S交联桥的位置第04章蛋白质的共价结构小结（2）序列分析中的重要方法和技术有：测定N-末端基的苯异硫氰酸酯（PITC