分析茶树ppo同工酶

茶树PPO同工酶潘欣、乔如颖同工酶一、概念不同种类、不同器官和组织起源的酶可做用于同一底物，催化相同的化学反应，但其性质可以不尽相同。（1895，Fischer）目前，50%以上的酶分子都已发现有同工酶的存在。同工酶同工酶之所以能催化相同的反应，是因为其在活性中心结构上有类同之处。而它们之所以存在着物理特性、催化性质及免疫性的区别，也由于在分子组成和结构上有一定的差异。同工酶二、同工酶一级结构的差异1、相对分子质量不同，氨基酸组成相差悬殊。2、相对分子质量接近，但氨基酸组成及水解后肽谱不同，免疫性质也不同。3、相对分子质量接近，氨基酸组成类似，水解后肽谱也较近似，但免疫性质不同。同工酶三、构象变化造成同工酶的差异一级结构相同的同工酶，可以存在不同的构象，形成所谓构象同分异构体。互变性同工酶不互变性同工酶四、同工酶亚基的杂交同工酶的亚基在一定条件下能解聚为单体，又

能在一定条件下重新聚合或重组成新的杂交体。同工酶五、同工酶与基因1、单基因决定的同工酶。2、多基因决定的同工酶。3、复等位基因决定的同工酶。4、修饰同工酶。同工酶六、几种常用分离和测定同工酶的方法–1、电泳●▽●2、层析3、热稳定性4、动力学5、免疫法电泳：区带电泳是最常用的分离同工酶的方法，采用高分辨率的支持物如淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶可获得满意的分离效果。近年来采用的等电

点聚焦电泳还可以分离出一级结构相同而空间构象不同的酶分子。但是能被电泳法分离的不一定是同工酶，酶带的数目也不一定代表同工酶的数目。同工酶七、同工酶的类型鉴别方法原级同工酶次级同工酶同一种酶多基因位点复等位基因电泳速度，等电点离子交换不同常不同常不同相同热稳定性不同不同或接近不同或接近相同动力学性质不同常不同常相同或接近相同免疫性不同，可交叉常交叉常相同相同相对分子量不同，常接近几乎相同不同或接近相同PPO酶与PPO同工酶PPO酶：编号：EC1.10.3.1。一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。PPO同工酶：催化相同的化学反应（催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能催化单酚单加氧酶），但其性质可以不尽相同的一类酶。PPO同工酶茶树PPO同工酶的研究最早是20年代初，

1963~1966年，Bendall和Gregorg分离了7种同工酶，1971年Pruidze等人分离出2种同工酶，1974年Buzan等人测定了这2种同工酶的分子量，近年的实验结果表明PPO的酶谱中，多的可达10条。PPO同工酶的分离提纯PPO同工酶的应用PPO同工酶的分离提纯PPO同工酶的分离一般采用聚丙烯酰 胺等电聚焦电泳（垂直平板电泳）和 圆盘电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：浓缩效应

电荷效应

分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶电泳1、凝胶柱的制备本法系采用连续体系，凝胶浓度为7.2%，其制胶液配方如下：制备程序①配胶从冰箱中取出A、B、C、D液平衡到室温，在一滴瓶中按比例分别加入A、B、D各液摇匀，抽真空除氧，速加入C液。②装柱混匀立即用毛细管分装于各支电泳玻管中，(凝胶管事先在距一端1.5厘米处划一刻线，另一端用医用胶布封闭并直立于椽皮塞座的底板上，并在各管内滴加3滴40%蔗糖液)。③覆水制胶液加至刻度线后，随即用注射器沿管内壁缓慢加入0.2—0.5厘米厚水层覆盖胶液面，以免胶液面形成凹面和隔离空气。④成柱开始复盖的水层与胶液面之间有分界面，随后消失，当界面又出现时，表明凝胶聚合反应完成，由此即得凝胶柱。2、加样与电泳加样前除去凝胶管下端的封闭胶布，用滤纸吸去凝胶柱上端的水层，垂直插入电泳槽中，下槽已装满电泳缓冲液，装上上槽，用微量注射器将待电泳样液加入电泳凝胶上端，样品用量40-100微升，再用普通注射器在样品层上缓缓加满电泳缓冲液，随即将上槽也装入缓冲液，再加入约1毫升的0.001%溴酚兰液，作为电泳时示踪标记，盖上电泳槽盖，放入冰箱后接通电源，上槽负极，下槽正极，初电流2毫安/管，30分钟后调至3毫安/管，待示踪标记泳动距电泳管下端0.5厘米处，停止电泳，时间约2.5-3小时。电泳温度上槽27℃左右，下槽21℃左右。3、剥胶电泳结束后，倾出电泳缓冲液，取下电泳凝胶管，用7号长针头注射器沿管内壁插入，一面注入蒸馏水，一面推进并转动凝胶管，待针头前进到约管长的2/3处，拔出针头，再从另一端以同样的方法进行，这样电泳凝胶便完整地从电泳玻管内剥出。4、染色和漂洗染色液：1%邻苯二酚溶液+0.06%邻苯二胺液(用0.01M草酸配制)+0.05M磷酸缓冲液，按3:1:1混合。漂洗液：乙醇95%:醋酸:水=10:15:15。把剥出的胶柱放入盛有酚-胺染色剂的具塞指管内，染色2.5小时左右，后漂洗5小时左右(中间换漂洗液2一3次)，即显示出棕色的茶多酚氧化酶同工酶谱带。显色后的凝胶柱浸泡于蒸馏水中，可保存较长一段时间不退色。聚丙烯酰胺等电聚焦电泳等电点聚焦就是在电泳槽中放入两性电解质载体，通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的PH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同蛋白质即移动到或聚焦于与其相当的等电点PH位置上。PPO同工酶的应用同工酶分析已广泛应用于植物种质资源、遗传育种、生理代谢、个体发育及适应不良环境变化等研究领域。同工酶技术是研究物种分类以及确定物种亲缘的一种重要而有效的手段，现在我国科

研人员还通过研究同工酶，探讨茶树的起源，品种的早期鉴定，加工中同工酶的变化对品

质的影响等问题。多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化形成茶黄素、茶红素和其它的氧化聚合物，同时伴随儿茶素的氧化，氨基酸、胡萝卜素等香气前体发生偶联氧化，产生各种各样的香气化合物，并形成红茶的基本风味。茶色素是一类茶多酚氧化的产物，具有生理活性。目前茶色素在临床上已经用于防治心脏病、高血脂、高血压等心血管疾病，另外还用于抗癌、抗突变、抗菌、抗病毒等功效。红茶制造中PPO同工酶谱与活性的变化试验方法1、工夫红茶的制造与取样方法采摘来的鲜叶，薄摊于25一28℃(空调控制)下萎凋20小时左右，每隔4小时取样1次;萎凋叶在微型揉捻机上揉捻60分钟，在30分钟和揉捻完毕时各取样1次；揉捻叶摊放于竹盘，上盖一湿润的纱布，任其在30℃下发酵，每隔50分钟取样1次；发酵叶置于恒温千燥箱中于10℃下烘至7成干，取样1次，摊凉，再在80℃下烘至足千，即为毛茶样。2、萎凋叶水合处理将萎凋叶茎部浸演于盛有蒸馏水的瓷盘边缘，任其吸水，每隔3小时取样1次。酶液的提取分离及活性测定1、酶试液制备取待测样0.50克，加不溶性PVP0.30克，石英砂2克及适量预冷Tris-Gly缓冲液，在冰冷的研钵中迅速研磨成匀浆，并以上述缓冲液定容至10毫升，再放置4℃的冰箱中浸提12小时，再过滤，并以

4000转/分离心15分钟，上清液即用于活性测定及同工酶谱分析。2、酶活性测定采用Hilton方法，稍加改进，以每分钟每克干样OD460nm增加0.1为一活性单位。3、同工酶分离技术采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳分离法。染色后的凝胶在CS一910双光束双波长薄层扫描仪上于680nm处扫描测定各同工酶谱活性。结果分析1、鲜叶萎凋期间PPO同工酶谱带变化萎凋期间PPO同工酶组分相对活性变化很大，在分离出的6条谱带中，萎凋期间活性明显增加的是PPO1、PP02、PP06，其次是

PP03，而PP04、PP05两带变化较平稳。在鲜叶和4小时萎凋样中，PP02、PP03仅仅隐约可辨，但在萎凋结束时，均已成为主要酶带。2、萎凋叶水合过程中同工酶谱的变化萎凋失水是PPO

活性降低的主要原因。萎凋叶水合过程中，PPO同工酶有较大变化，其中，PPO3、PPO4、PPO6表现出不同

程度的增加，而PPO1、PPO2、PPO5变

化较平稳。3、揉捻过程中同工酶谱的变化揉捻一经开始，低分子量的PPO6立即消失，PPO4、PPO2也仅隐约可见，而PPO1、PPO3、PPO5则活性基本保持不变，并成为发酵期间起主导作用的酶蛋白组分。可见，

PPO2、PPO4、PPO6属对多酚类敏感性强

的酶蛋白，而PPO1、PPO3、PPO5则表现

出很强的多酚不敏感性。4、发酵过程中同工酶谱的变化发酵过程中，PPO1始终保持着相对较强的活性，其他几条酶带活