植物基因组学(2018版)-蒋立希

植物基因组学PlantGenomics浙江大学(农业与生物技术学院)蒋立希教授概述基因组学的定义基因组——细胞中所有的DNA，包括所有的基因和基因区域。染色体上的DNA、细胞器中的DNA。基因组中不同的区域具有不同的功能，有些是编码蛋白质的结构基因，有些是复制或转录的调控信号，有些区域的功能还不清楚。基因组学——研究基因组的一门学问。“基因组学”这个词最早于1986年由美国科学家ThomasRoderick提出，是一门关于基因组图、测序和基因组分析的科学。这门科学还在迅速发展之中，但侧重点已经从当初的作图与测序，到基因组功能的研究。为了反映这个转变，基因组分析可以分成“结构基因组学”与“功能基因组学”两个大部分。电子显微镜下面染色体的外观

Confocal显微镜下面植物染色体的外观为什么要研究基因组？1、基因组研究的目的是从全局上阐明一种生物中所有遗传信息的组织和功能。2、基因组研究的内容包括所有水平上遗传信息的加工及基因和基因产物之间的相互作用，以及基因组的比较和进化。结构基因组学和功能基因组学结构基因组学：研究基因组的结构，是基因组研究初始阶段的主要工作。最终目的是构建某一个物种高分辨率的“遗传图”、“物理图”、以及“转录本图谱”。某个物种最终的物理图谱，是它的完整的DNA序列。基因组图分别率基因组图：细胞学图、遗传图、物理图、序列图，分辨率逐级提高基因组学结构基因组学功能基因组学基因连锁分析分子细胞学物理作图EST测序全基因组测序全基因组的结构基因的表达正向遗传学反向遗传学生物信息学比较基因组学蛋白质组学等等基因组研究的特点基因组研究是基因组学的核心内容。或者说，基因组学其实就是基因组研究。基因组学是高效的遗传学。与传统的遗传学比较，基因组学具有全局性、高效性、综合性和先进性的特点。1、全局性（Overall,genome-wide）：以整个基因组为研究对象，而非具体到单个特定的基因。2、高效性（High-throughput）：研究方法是平行的、高通量的，一次试验可产生大量的数据。3、综合性：需要多学科的合作，包括生物学、化学、统计学、机械技术、电子技术、信息技术等。4、先进性：将现有各种最先进的技术应用到极至，同时也推动了各种技术的高速发展。真核生物与原核生物基因组的区别基因组大小染色体着丝粒染色体端基因组结构重复序列真核生物大多条线状有有基因排列松散被内含子间隔高原核生物小单染色体环状无无基因排列紧密无内含子没有或很低真核生物与原核生物基因组的一些例子支原体布鲁氏科寄生菌裂殖酵母基因组的大小基因组的大小：指的是物种单倍体基因组的大小。即便是同一个物种，它不同的细胞，所携带的染色体倍数是不同的：性细胞的染色体组数目是体细胞的一半。基因组的大小可以通过C值来表示，C值的大小通过DNA双链解开与复合的速率来测算。基因组的大小–CValue基因组越大，DNA重复序列越多DNA双链退火重合所需时间越长，C值越高基因组的大小–C0T1/2C0T1/2=“DNA浓度”与“双链退火复合所需时间一半”的乘积，这个乘积直接与基因组内DNA的数量相关。物理参数与实测碱基对数目间的相关性

物种之间基因组大小的差别

物种间基因组的大小差别巨大，从病毒基因组的5x103bp到植物的103Mb。在哺乳动物之中，最大的基因组只是最小的基因组的两倍；而在植物界，物种之间基因组的大小差异达100倍之多。物种之间基因组大小的差别

爬行软骨质的鱼棘皮类甲壳类软体动物支原体1kb10kb100kb1Mb10Mb100Mb1Gb10Gb100Gb部分植物基因组大小之比较

基因组序列的重复性

在一种生物类别中，基因的数目其实并不相差太大，而基因组的大小的差别却有100倍之多。例如，在开花的植物之中，基因数目在3-5万个之间，而基因组的大小却相差巨大，拟南芥的基因组是小麦的百分之一。因为在大型的基因组中存在着大量的重复区域。一些物种基因组内不同序列类别的比例

斑马鱼鼠蛙DNA重复序列

DNA重复序列：指在基因组中，超过一个拷贝的重复序列。串联重复序列(Tandemrepeats)：指在基因组中，前后相连的重复序列。分散的重复序列(Dispersedrepeats)：指分散在基因组不同区域的重复序列。两种分散的DNA重复序列

SINES(ShortInterspersedElements)：片断小于500bp，重复次数在100,000-1000,000LINES(LongInterspersedElements):片断大于5KB,重复次数10000次以上。内含子与外显子2、外显子(Extron)：一个基因的编码区域。1、内含子(Intron):不翻译成蛋白质的DNA序列片断。最早在1977年的时候，鸡的蛋白清，以及兔子、老鼠的血色素蛋白中发现。在原核生物与低等的真核生物（如酵母）中，很少有内含子。不同物种基因外显子数目统计三个物种基因内含子数目统计酵母果蝇染色体上重复序列的位置常染色质常染色质串联重复串联重复DNA微卫星内含子、外显子、LINEs、SINEs、微卫星与mini微卫星内含子、外显子、LINEs、SINEs、微卫星与mini微卫星串联重复异染色质异染色质小结1、原核生物与真核生物的基因组大小相差极大。2、在同一类生物之中，不同物种基因的数目相差并不大，但基因组的大小差别却可以达到100倍之巨。3、基因组的越大，重复序列的比例也越高。4、越是高等生物，单个基因平均内含子与外显子的数目也就越多。第一讲基因的表达及全基因组基因表达研究1.1何谓基因的表达1.2如何分析单个基因的表达1.3如何在全基因组水平上研究基因的表达Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudents1.1何谓基因的表达PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein转录逆转录翻译基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。差别基因表达(differentialgeneexpression)指细胞分化过程中，基因按一定的时空顺序表达，表达的基因数约占基因总数的5%～10%。也就是说，某些特定基因表达的结果生成一种类型的分化细胞，另一组基因表达的结果导致出现另一类型的分化细胞，这就是基因的差别表达。其本质是开放某些基因，关闭某些基因，导致细胞的分化。Genome-wideanalysisofgeneexpression1.1何谓基因的表达PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein转录逆转录翻译在RNA聚合酶的催化下，以DNA为模板合成mRNA的过程称为转录（transcription）。在双链DNA中，作为转录模板的链称为模板链（templatestrand）或反义链（antisensestrand）；而不作为转录模板的链称为编码链（codingstrand），编码链与模板链互补，它与转录产物的差异仅在于DNA中的胸腺嘧啶（T）变为RNA中的尿嘧啶（U）。在含许多基因的DNA双链中，每个基因的模板链并不总是在同一条链上，亦即可作为某些基因模板链的一条链，同时也可以是另外一些基因的编码链。转录的过程Genome-wideanalysisofgeneexpression1.1何谓基因的表达PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein转录逆转录翻译分子杂交Genome-wideanalysisofgeneexpression分子杂交（molecularhybridization）确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。1.1何谓基因的表达PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein转录逆转录翻译翻译的过程以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程。这个过程包括肽链的延长、肽链的终止，以及译后加工（postranslationalprocessing）：从核糖体上释放出来的多肽需要进一步加工修饰才能形成具有生物活性的蛋白质。翻译后的肽链加工包括肽链切断，某些氨基酸的羟基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等。）。Genome-wideanalysisofgeneexpression1.1何谓基因的表达PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionATGTAATGATAGORF=OpenReadingFrameCDS=CodingSequenceExtron/IntronURT=UntranslatedRegion5’regulatingsequencePromoter/Stopsequence1.2如何分析单个基因的表达PlantGenomicsforundergraduatestudentsRT-PCRRT-qPCRNorthernBlot报告基因（GUS,GFP）原位杂交Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudentsProceduresandPrinciplesStep1:Denaturing94-95oC,3min.Step2:Denaturing94-95oC,50sec.Annealing55oC,1min.Extending68-72oC,1k/1min.Step3:Extending68-72oC,10min.Step5:Storageat4oC,forever30-35cyclesnormally5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’

PCRtechnology(1)Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudents

PCRtechnology(2)5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Theoretically,thenumberofDNAmolecules=2nn=numberofPCRcyclesNumberofcyclesNumberofDNAMolecules10203040Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudents

PCRtechnology(3)Theoretically,thenumberofDNAmolecules=2nn=numberofPCRcyclesNumberofcyclesNumberofDNAMolecules10203040PCRcocktails:Buffer(10x)normally1/10dNTP1μlfor25mM

MgCl21μlfor10mM

DNATemplate60-1000ngTaqpolymerize60-1000ngFactorscausinglowPCRefficiencyTissuesPrimersGenome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpressionpattern–withRTPCR(1)100bp500bp1.0kb100bp500bp1.0kbABSeedling

Leaves

FloralbudsSsiliquestage1Ssiliquestage2Ssiliquestage3Ssiliquestage4ActinBnALCSterilewaterSeedling

Leaves

FloralbudsSsilique1Ssilique2Ssilique3Ssilique4SterilewaterPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpressionpattern–withRTPCR(2)

M12345HomozygousmutantRNAHeterozygousmutantRNAWidetypeRNAForanyPCRexperiment,controlisveryimportantPositive:4(m)and5(w)withactinspecificprimersNegative:3waterwithgenespecificprimers122PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withQuantitativePCRTechnology(1)NumberofDNAMolecules1020304050PCRCyclesPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withQuantitativePCRTechnology(2)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withNorthernBlot(1)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withNorthernBlot(2)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withNorthernBlot(3)1049bp595bp45321b1a2345678PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionPTGUSReporter:VGD1Promoter-GUS-Tnos

Studygeneexpression–withGUSreportergenePlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withGUSreportergeneGUSReporter:ALCPromoter-GUS-TnosPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withGFPreportergeneGFPReporter

:

VGD1Promoter-GFP-TnosPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withGFPreportergenesPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withRFP/YFP/GFPreportergenesPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withinsituhybridizationThetpd1mutantlackstapetalcellsATA7Probe(tapetum-specific)SDSProbe(Msc-specific)AMscTTCMscDWTtpd1MscPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withinsituhybridizationInSituHybridization:VGD1cDNAasprobePlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–Subcellularlocalization(1)FusionProtein:VGD1Promoter-VGD1-GFP-TnosSub-cellularLocalizationofVGD1ProteinpgHpgIcpptcpcpcwcwI10µm10µmPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–Subcellularlocalization(1)FusionProtein:35SPromoter-SPL-GUS-Tnos双螺旋如何杂交？DNASTAR(Lasergene)DNAEditMapDrawMegAlignPrimerSelectSeqManABCDHuaetal.,2009,Planta1.5kb1.0kbAMarkerBBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aHuaetal.,2009,PlantaBA12345Huaetal.,2009,PlantaABCHuaetal.,2009,PlantavalvevalvereplumvalvevalvereplumreplumvalvevalveDZCDBDZDZDZreplumAvalvevalveHuaetal.,2009,Planta981234567500bp700bpHuaetal.,2009,PlantaPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因转录本PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因表达的高通量分析主要方法1、DD（DifferentialDisplay）、cAFLP、SSH(SuppressionSubtractiveHybridization)2、SAGE(SerialAnalysisofGeneExpression)3、MPSS(MassivelyParallelSignatureSequencing)4、基因芯片（Microarry）5、RAN-seqPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因差异显示分析(DD)实验过程：1、分别从样品与对照的相关组织中提取totalRNA。2、分离信使RNA，并合成cDNA文库3、用随即的oligoT引物来进行PCR扩增。4.、在polyacrylamide上进行分离5、克隆差异的电泳带6、对差异的电泳带进行测序。7、对差异进行注释与对差异基因进行功能分析PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因差异显示分析(DD)的结果PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因差异显示分析（cAFLP）cDNAPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionSSH:SuppressionSubtractiveHybridization通过PCR技术，专门扩增两个样品中表达不同的那部分基因要通过杂交与PCR两个过程PCR的结果经过筛选，剔除假阳性信号试剂盒Clonetech公司销售基因差异显示分析-抑制性扣除杂交SSHPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression抑制性扣除杂交的结果（例）PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片（DNAarray）-尼龙膜上点样用放射性物质标记探针，这是一种经济的方法PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片（DNAMicroarray）-概况？原则上是在玻璃片、尼龙膜或其他材料上点上一系列的DNA片段，然后与不同的转录本探针进行杂交。这些有序排列的“点”可以是细菌克隆、纯化后的质粒DNA、插入片段、或者是核苷酸片断。点样的密度可以达到每片10万个多种高技术的有机组合PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片（DNAMicroarry）-几种常见的技术高速的机器手在玻璃芯片上点样，通常是点经过PCR扩增的cDNAs，所谓芯片的“印制”依赖高速机器手，点长片段的核苷酸技术）用所谓的照相平板印刷法，直接在芯片上合成25mer的多低聚核苷酸(AffymetrixGeneChips)用“铝镜”技术在芯片上直接合成25-70mers的低聚核苷酸(NimbleGeneChips技术)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression低聚核苷酸芯片的分析过程代替芯片上的一个一个基因，低聚核苷酸芯片用的是低聚核苷酸（25-mers）制作过程用特殊的感光技术，如同用在半导体芯片上的一样mRNA样品分别地与芯片进行反应，而不是像在SpotArray中那样成对地进行PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression低聚核苷酸芯片的制作过程1、一张被光照保护玻璃芯片上的基质，选择性地接受光处理。2、透光部分被激活。3、单核苷酸为反应原料，经过温育，受激活的基质发生化学反应，逐渐合成聚核苷酸。4、用其他光保护（罩子）处理。5、重复上述步骤延长核苷酸链。PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析过程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析过程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析过程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析过程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression电脑技术在生物芯片分析中的应用基因系列的选择探针的设计扫描杂交结果图像的分析芯片、样本的标准化设定等基因的聚类分析：那些基因似乎在同一个代谢网络Genome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片

（Microarray）-实验设计BiologicalQuestionSamplePreparationMicroarrayReactionMicroarrayDetectionDataAnalysis&ModelingPlantGenomicsforundergraduatestudentsPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression影响种子油分的积累环境因子环境光照温度水分CO2浓度矿质养料栽培措施PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression温度响应QTL的发现sR6293b50.4cMCB10530b51.7cMO113G0554.6cMHG-FT-C258.8cMTapidorNIL-9NIL-1Ningyou-7LOD4123qocc2-2遗传图谱/QTL遗传作图与物理作图遗传作图(Geneticmapping):利用遗传学的原理与技术，在图谱上显示基因或者DNA序列特征的相对位置。物理作图(Physicalmapping):。利用分子生物技术手段构建图谱，在图谱上直接精确地显示基因或者其他DNA序列。遗传图地图是通过一些显著的标识（如河流、湖泊、山脉、道路、城市、单位、建筑物等）来显示地理情况的。与此相似，遗传图也必须利用一些显著的标识（称为遗传标记）来显示基因组的组织结构。控制易于识别的质量性状的主基因是首先被使用的遗传标记。通过分析遗传标记间的连锁关系来构建遗传图重组率与遗传图距重组率（r）的计算式为：r=重组型/(亲本型+重组型)如右图例子：r=(76+75)/(542+537+76+75)=0.1228作图函数：Haldane作图函数r=[1–exp(–0.02D)]/2Kosambi作图函数r=[1–exp(–0.04D)]/2[1+exp(–0.04D)]式中：D=两基因间遗传图距图距单位：1cM（厘摩）=1%重组率；100cM=1M厘摩是一个理论值，不是一个物理值如何作遗传图谱MAPMAKER:EricLander编程著名的遗传图绘制软件。网址：/soft/mapmaker/300*500常见的作图群体有DH群体，F2群体等遗传标记根据遗传多态性表现的水平，遗传标记主要有以下几种类型：形态标记：在形态性状水平上表现出来的遗传多态性，通过直接肉眼观察或简单的检测即可识别，如花色的有无、植株的高矮、种子的形状等。生化标记：在生化性状或蛋白质水平上表现出来的遗传多态性，必须通过生化分析加以识别。同工酶是最常用的生化标记。分子标记：DNA序列水平上表现出来的遗传多态性，必须借助分子生物学手段加以识别。蒋立希，1991.中国油料第一期酵母中一些典型的生化标记酵母中常用一些营养缺陷和对有毒物质的抗性做为遗传标记。可以通过在培养基中添加一些营养物质或有毒物质，对这些标记性状加以识别。腺嘌呤刀豆氨酸环乙酰亚胺亮氨酸酵素尿嘧啶遗传图谱DNA分子标记的种类RFLP：RestrictionFragmentLengthPolymorphismsRAPD：RandomAmplifiedPolymorphicDNASSLP：SimpleSequenceLengthPolymorphismSNP：SingleNucleotidePolymorphismAFLP：AmplifiedFragmentLengthPolymorphismMicrosatellitesLandryetal,1991.Genome103个RFLP分子标记覆盖了整个甘蓝型油菜的基因组20多年前油菜遗传图谱与QTL定位的发展277个分子标记，平均密度是7.2cMQiuetal,2006.TAG12年前，前一个油菜973项目开始的时候！

油菜遗传图谱与QTL定位的发展Homozygouscombiningfavorablealleleson9QTLscanincreaseoilcontentfor9%Zhaoetal.,2012.

Theor.Appl.Genet.,124:407-421七八年以前，SG图谱上的标记达到700个，局部的精细加密达到数十个KB油菜遗传图谱与QTL定位的发展全基因组关联分析全基因组关联分析（Genome-wideassociationstudy）是指在物种全基因组范围内找出存在的序列变异，一般是最丰富的单核苷酸多态性（SNP），从中筛选出与某一个农艺或者品质性状相关的SNPs。关联分析是一种基于连锁不平衡来识别分子标记之间或候选基因与性状之间关系的方法。连锁不平衡：连锁不平衡(linkagedisequilibrium)是指在某一群体中，不同座位上某两个基因同时遗传的频率明显高于预期的随机频率的现象。HLA不同基因座位的各等位基因在人群中以一定的频率出现。简单地说，只要两个基因不是完全独立地遗传，就会表现出某种程度的连锁。这种情况就叫连锁不平衡。连锁不平衡可以是同一条染色体上的不同区域，也可以是不同染色体上的。物理作图一系列相互重叠的克隆序列，跨越某染色体区域。FISH图示（1）FISH在染色体上标记FISH在BAC上的标记FISH图示（3）-人类第11号染色体PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression温度响应QTL的发现sR6293b50.4cMCB10530b51.7cMO113G0554.6cMHG-FT-C258.8cMTapidorNIL-9NIL-1Ningyou-7LOD4123qocc2-2遗传图谱/QTLPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression温度响应QTL的发现ABCDEABCDEABCDEABCDE202个DH株系PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression取每一代自由授粉种籽验证含油量表型，结合分子标记辅助选择回交亲本，通过4代回交，获得了含油量QTL-近等基因系群体，其中NIL1与NIL9的遗传背景缩小到9cM的狭窄区域内，这两个近等基因系对温度具有不同的感应，种子含油量相差3个百分点。响应温度的含油量近等基因系的构建42.60%39.65%NIL9NIL1PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression温度对种子油脂基因的影响NIL9:HighoilcontentNIL1:LowoilcontentTreatment1: Lowtemperature,21℃daytime;16℃innight

NIL9:HighoilcontentNIL1:LowoilcontentNIL9:HighoilcontentNIL1:LowoilcontentTreatment2: Normaltemperature,25℃daytime;18℃innight

Treatment3: Normaltemperature,29℃daytime;20℃innight

aRNAsaRNAsaRNAs提取成熟期种子的RNA进行基因表达差异分析。试图找到究竟哪些基因对温度感应的不同，从而种子油分积累产生差别的。Zhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression温度对种子油脂基因的影响Zhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionCombimatrixBrassica90Karray

所采用的芯片是加拿大PBI2008年春天研制出来的CombimatrixBrassica90Karray，这个芯片上的基因来自油菜的种子，一共有10万多个点，986个blocks。整个实验用了36张这样的芯片。Zhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression三种温度条件下近等基因系差异表达的

共性与特性T1T2T33963681864T1T2T3699295GlobalDEGsDEGsatqOC.C2.2

AB96781152815015248T2:25139(15.5%);T1:2933460(11.7%);T3:3499558(15.9%)Global39,QTL6,alwaysdifferentbetweenNILsZhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression温度种子生长发育生物/非生物逆境光合体系代谢作用调控体系光吸收光合作用光化学调节受精胚发育脂肪酸蛋白质细菌重金属HSP转录转录后信号传导温度调控种子含油量的途径Zhuetal,2012,TAGEffectofhighnighttemperatureonseedoilcontentandfattyacidcompositionHighnighttemperaturepromotesseedoildecompositionGivenappropriatedaytimelightintensityandtemperature,thechangeofNTwouldchangetheefficiencyofphotosynthesis.Zhouetal2017,JXBTherapeseedcultivarsusedinthestudyJR:Oldcultivar,featuredwithrelativelylowSOC(35%),buthigherucicaicdcontent(30%)ZY:Newcultivar,featuredwithrelativelyhighSOC(50%),nearlyzeroerucicacid(0-5%)However,itisactuallynotyetexactlyknown,…toaddressthesequestions,wedidanexperimentwithtwolocalrapeseedcultivarsinsuchgrowthchambers.TowhatdegreehighNTcanreduceSOCinrapeseed?WhatthechangeofthetranscriptometoadapthighNTis?IfthereareanygenotypicdifferencesreactinghighNT?WhatastrategywecouldtaketoavoidtheSOCreduction?PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionJRZYGCB2JRZYZYJRJRZYGCB1Temperature(oC)ClocktimeFigure1PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionFAcontent(μg/mg)LowNTHighNTJR******FAspeciesandtotalFAZY****C14:0C16:0C18:0C18:1C18:2C18:3C20:0C20:1C22:0C22:1C24:0→1%→0%0%→0%4%→4%5%→5%2%→1%3%→2%35%→33%57%→54%15%→16%20%→21%9%→10%10%→12%2%→1%1%→1%4%→4%1%→1%2%→2%1%→1%25%→27%2%→2%1%→1%1%→1%(JR)(ZY)LowNTJRhighNTJRlowNTZYhighNTZY(a)(b)(c)RelativeproportionsofFAspecies→Fromthecomparisonsabove,weclearlyseethathighNTcausedhightranscriptionallevelofthegenesontheglyoxylatecyclepathwayandplanthormonesignalpathwayinthesamplesharvestedat5:00.Therefore,ourinvestigationfurtherdeepenandnarrowdowntothegenesonthesetwopathways.Firstofall,wenoticedthegenesontheglyoxylatecyclepathwayarefeaturedwithcis-actingsiteGAGA-similarmotifabout1kbupstreamofstartcodon.ThemotifsaccordingtoresearchonDro’sophila,isconservativeforHEATSHOCKPROTEINgenes.So,wesupposethesegenesshouldalsorespondtoincreasingtemperature,asthehighNTelevatedtheexpressionallevelofthesegenes.Thecis-actingsiteGAGA-similarmotif1kbupstreamofthegenesonglyoxylatecycleGenesandtheirhomologsontheglyoxylatecyclepathwayPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionBnCTSBnLACS6BnACT1BnACX4BnMFP2BnAIM1BnKAT1BnPKT1BnECH2BnDCI1BnECI1BnRedBnHIBVHBnCGI58BnGA20ox1BnGA20ox5BnGA3ox3BnGA3ox4BnGA2ox1BnGA2ox2BnGA2ox3BnGA2ox4BnGA2ox6BnGA2ox7BnGA2ox8A/CE/GB/DF/HA/CE/GB/DF/HPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionGA3CK(H2O)PAC2013201420132014HZHZHZHZJHJHJHJH*****JRZY**(b)(a)Oilyield(kg/ha)TreatmentsPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionSAGE分析–图示从特定组织中提取mRNA，通过反转录成为cDNA。通过限制酶切从每条cDNA得到一条长15bp的片段，称为SAGE标签。将来自各种cDNA上的标签接成许多串联复合体，并将其克隆。对这些克隆进行测序，然后统计各种标签的数量。这样就能了解各种mRNA的相对丰度。第二讲基因组水平上基因功能研究及如何研究单个基因的功能2.1突变体库的建设对基因功能研究的意义2.2反向遗传学研究的手段2.3如何全面地研究单个基因的功能2.4蛋白组学ABC

Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents何为“正向遗传学”与“反向遗传学”传统的遗传学也称为正向遗传学，它是在已知基因功能的前提下，去寻找基因（序列）的，亦即“从功能到基因”。功能基因组学正好相反，它是在已知基因（序列）的前提下，去寻找基因功能的，亦即“从基因到功能”，所以也称为反向遗传学。突变体表现型所牵涉的基因?基因序列基因的功能所带来的表现?Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents正向遗传学–从现象到基因序列T-DNA插入Ac/Ds转座子插入图位克隆（物理化学诱变）突变体库基因克隆序列研究Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsIdentifymutantswithtraitofinterestRelatephenotypetogenotype4,6gseeds0,6gSeedsForwardGeneticsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsIdentifymutantsincandidategenesTestforphenotypiceffectofmutantgenotype4,6gseeds0,6gSeedsReverseGeneticsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents突变体库对于遗传学研究的意义随着许多物种全基因组测序的完成，以及数据库中现有的成百上千的ESTs序列，如何地来分析这些基因的功能、如何来理解基因与基因之间在生物体内的相互作用是一项重要的工作。基因功能的预测建立在与其他物种同源基因之间的比对，但许多基因的预测功能与他们实际的功能并不一致。还有许多的基因功能尚未归类。突变体在研究基因的功能的过程中十分重要。Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents产生突变体库的方法研究一个基因的功能，最可靠的方法是把一个基因的结构破坏掉，然后研究破坏后的表现型。借助大量的突变体，将会加速人们对这个物种基因功能的研究。两种最常见的方法是：1、插入突变2、缺失突变3、物理化学诱变mutagenesisadvantagesdisadvantagesinsertionalT-DNA获得旁翼序列geneticallymodifiedorganism(GMO)*transposonsFST,rapidlocalsaturation(e.g.twocomponentsystemAc/Ds)GMO,preferentialintegration“islands”不够均衡retrotransposonsFST,preferentiallytargetinggenespace,non-GMO**TOS17,onlysystemdemonstratedinOryza

sativachemicalchromosome&pointmutations点突变随机/未知/剂量/不利植物physical方法便利、点突变与大片段缺失随机与未知*GMO:green-andscreen-house,publicacceptance**activatedthroughinvitrocultureandγ-rays(S.Nielen,2000)制造突变体的各类方法比较source:FAO,IAEAComprehensiveReviewinrice:Wangetal.MolecularPlant,6:596-604(2013)Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突变插入突变作为研究基因组基因功能的有效手段，广泛地应用于植物、哺乳动物的基因功能的研究。这个技术手段的优势在于，插入片段的序列已知，并且携带容易识别的报告基因。其中，常用的插入突变技术有T-DNA插入突变Ac/Ds转座子插入突变Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突变-拟南芥Ac/Ds基因或增强子捕获系统Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突变–拟南芥Ac/Ds基因或增强子捕获系统;;++++XDs(KanR);NAMSAc(NAMS)+;+++++;F1Ds(KanR)+++Ds(KanR);NAMSAc(NAMS)Ac(NAMS)Ds(KanR);NAMS

StartlinesScreeningforphenotypeand

GUSexpressionKanselectionF2F3TranspositionGerminate1000seeds,selectKanR+NAMRseedlingsonlyGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突变–拟南芥Ac/Ds基因或增强子捕获系统SET1003:EmbryosacSGT10019:PollengrainsSET1052:StyletissueSGT10003:EmbryonicroottipintorpedostageSGT10030:TrichomesandLateralrootsSET

1025:EggapparatuswithintheembryosacGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（从一个基因组中）全面地来研究一个基因？

Phenotyping:

过程中，要非常细心地观察各自负责的突变体有别于野生型的性状是什么，这部分工作叫Phenotyping。有些突变性状诸如根长、根系特征、叶型、叶色、花色、花瓣数目、株高、分枝数目、荚果形状、种子大小、种皮颜色等，肉眼直接看得出来；还有一些需要通过做切片，然后用各种显微镜（体视镜、相差显微镜、稍描电镜SEM、投射电镜TEM、激光显微镜Confocal）观察，比如花药、胚珠的发育、种子内油体观察、花粉管、叶绿体、线粒体等细胞器，无论肉眼是否看得出来，还是显微镜观察，都要拍照，照片质量要高，清晰度、像素分辨率要一流的，最好还要有点艺术感（对一流杂志很重要！）Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（从一个基因组中）全面地来研究一个基因？2.Associationwiththegeneandphenotype：即你所观察到的突变性状是否由被T-DNA插入而遭破坏的那个基因位点引起的，关联分析不外乎以下三种手段，好的杂志一般至少需要2种或2种以上的手段相互印证：等位变化：你的手头在某个基因位点上拥有包括野生型在内的数个等位突变体，这些等位变化是否不同程度地引起某种突变性状？这样比较（特别是对于数量性状）的前提是，等位突变体与野生型的遗传背景高度一致，遗传背景一致要通过不断的回交来到达，一般要回交3代，单株系谱选择；互补实验：简单地说就是从野生型中把某个基因克隆出来，再通过转基因手段转到突变体中去，看突变体是否能恢复到与野生型一样，当然过程细节并不是那样简单；回复实验：这个实验适用Ac/Dc插入系统，简单地讲就是拿突变体与Ac亲本进行杂交，看Ds跳开之后，突变性状能否回复正常。Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（从一个基因组中）全面地来研究一个基因？3.Analysisofgeneexpression：你所研究的那个基因在什么发育阶段或者在某个阶段的哪种组织中表达，研究基因表达的手段有：RT-PCR与数量RT-PCR：PCR技术基础上的表达分析有时不靠谱，因为采集组织的过程中只要有一点点污染，假阳信号会被PCR无限扩大；RNANorthernBlot：可以做到不同组织之间，无法更加精细地定位基因在局部区域的表达细节；RNA原位杂交：可以非常精细地定位到你的基因在哪几层细胞内表达，非常有价值但技术水准要求很高的一种基因表达分析实验；报告基因：通常把你的基因的启动子序列与GUS或者GFP这样的报告基因序列连在一起，然后转化野生型，通过观察GUS或者GFP荧光信号来确定你的基因在什么组织中表达，精细程度介于Northern与原位杂交之间。以上表达分析都是在RNA层面上的，在蛋白质层面上的表达研究更加可靠：WesternBlot：与NorthernBlot手段差不多，但探针是蛋白质抗体免疫金沉淀：也是原位杂交实验，与RNA原位杂交区别在于探针是蛋白质抗体Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（从一个基因组中）全面地来研究一个基因？4.Analysisofproteinfunction：如果你的基因编码某种酶，你要从突变体中提取它并看看它催化某种底物反应的能力是否与野生型存在差别？如果你的基因编码转录因子，通过分子构建做一个（带报告基因）融合蛋白，看看融合蛋白是否真的可以定位到细胞核？如果你的基因是一个激酶或信号肽，看能否定位到细胞膜上？如果你的基因与呼吸作用相关，能否定位到线粒体中去？…………….如果你幸运的话，直接可以采用携带你的融合构建的质粒DNA轰击洋葱表皮细胞，在观察洋葱表皮细胞就可以了，如果不太幸运的话，必须通过转基因的手段在转基因株中观察融合蛋白在哪里。比较高的境界是体外合成你的基因所编码的蛋白，比如在酵母或者在大肠杆菌中合成你的蛋白，再把蛋白纯化与底物反应，看看情况如何？

Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents拟南芥作为模式植物的优势:种植密度大，每平方米可达500-2000株，世代短，仅2-3月.繁殖系数高：~2000粒/株杂交技术相对简单基因组只有125MB转基因技术已经十分成熟T-DNA或玉米转座子Ac/Ds基因标示技术非常成功模式植物拟南芥在植物基因组学研究中不可替代的作用Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents例：插入突变–基因功能研究–VGD1的研究过程1、突变体的发现WT(Ler)CDsdsqWT(Ler)vgd1ABsdsqvgd1Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents例：插入突变–基因功能研究–VGD1的研究过程1、突变体的发现EFanstananGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents例：插入突变–基因功能研究–VGD1的研究过程2、突变体性状的遗传分析Theresultshowedthatthemutationledtomalegametophytedefect,whichislinkedwithkanamycineselectivemarkerthatwasca