水产品一般成分的检测-蛋白质的测定

蛋白质测定的主要方法及原理概述一凯式定氮法的原理二乙酰丙酮比色法的原理三目录页燃烧法的原理四双缩脲法的原理五福林酚法的原理六

蛋白质是构成生命组成重要物质，是由氨基酸之间脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物。

食品中蛋白质是人体重要的营养物质和食品营养指标。对其含量进行测定有利于合理开发利用食品资源，优化食品配方、控制生产过程、提高和监督产品质量。一、概述

蛋白质的测定按其原理可大致分为两大类：1.通过测定含氮量换算出样品蛋白质含量。如凯式定氮法、燃烧法等。2.利用蛋白质组成中特定氨基酸残基、酸性或碱性基团、芳香基团的含量，测定蛋白质含量。如紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝法、福林酚法等。

国标GB5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》中采用了三种方法，凯式定氮法、分光光度法和燃烧法。

蛋白质测定方法测定方法二、凯式定氮法的原理

蛋白质是含氮的有机化合物。样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出氨气，收集于硼酸溶液中。用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

食品中除蛋白质外，还含有其他含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。二、凯式定氮法的原理消化炉自动凯式定氮仪二、凯式定氮法的原理

优点

重现性好，应用范围广，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是蛋白质测定经典方法，测试结果准确。

缺点

操作比较繁复，费时，试剂消耗量大。

局限于样品中总蛋白质的检测，破坏蛋白质结构，易受到被测样品中其它有机含氮化合物（如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、含氮色素等）的干扰。三、乙酰丙酮比色法的原理

样品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。在pH4.8的乙酸钠一乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，计算出氮的含量，再乘以换算系数，即为蛋白质含量。

该方法适用于各种食品中蛋白质的测定，不仅能满足对工艺过程的快速控制分析，而且具有环境污染小，操作简便省时等特点。四、燃烧法的原理

将试样在900℃~1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体。其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测器(TCD)进行检测。计算出氮的含量，再乘以换算系数，即为蛋白质含量。

该方法需使用氮/蛋白质分析仪进行测定，适用于蛋白质含量在10g/100g以上的粮食、豆类奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的测定。五、双缩脲法的原理蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离，二价铜离子和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物，在540-560nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。

紫色络合物+双缩脲试剂五、双缩脲法的原理

由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物的颜色差别极小，使得该方法比较适合总蛋白质的测定。

该方法的优点为操作简单、测量速度快。缺点为灵敏度较差，精度不高。六、福林酚法的原理1.在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；2.是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)还原，产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。六、福林酚法的原理

优点

反应灵敏，检测限低，比较适合微量蛋白质的测定。

缺点

福林酚试剂在碱性条件下极不稳定，因而要求精确控制操作时间，且容易受到酚类、糖类、尿素等多种物质的干扰。

不同蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量不同，导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。水产品蛋白质的测定——凯式定氮法概述一原理二试剂与仪器三目录页分析步骤四注意事项五

凯氏定氮法是由丹麦化学家凯.道尔于1833年建立的，现已发展为常量、微量、半微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，是分析有机化合物含氮量的常用方法。

一、概述二、原理

凯氏定氮法的理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右，因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即：=N×6.25=蛋白质含量二、原理

蛋白质与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。三、试剂与仪器试剂

硫酸铜、硫酸钾、400g/L氢氧化钠溶液、0.0500mol/L硫酸标准溶液、20g/L硼酸溶液、混合指示液A（2份1g/L甲基红乙醇溶液与1份1g/L亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合）、混合指示液B（1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合）仪器

分析天平、凯氏定氮装置或自动凯氏定氮仪、酸式滴定管、铁架台等

四、分析步骤1.样品处理

称取充分混匀的固体试样0.2g~2g、半固体试样2g~5g或液体试样10g~25g(约当于30mg~40mg氮)，精确至0.001g。

消化

将样品移入干燥的定氮瓶或消化管中，加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸，轻摇后小心加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h~1h。

取下放冷，小心加入20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度,混匀备用。同时做试剂空白试验。四、分析步骤

2.蒸馏

装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。

四、分析步骤2.蒸馏

向接受瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1滴~2滴混合指示剂，并使冷凝管的下端插入液面下。根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL~10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并水封。夹紧螺旋夹,开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。四、分析步骤3.滴定

尽快以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点,如用A混合指示液,终点颜色为灰蓝色;如用B混合指示液,终点颜色为浅灰红色。同时做试剂空白。

如使用自动凯氏定氮仪，消化完成后，消化管冷却后加入50mL水,于自动凯氏定氮仪上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。结果的计算试样中蛋白质的含量按下式计算：

式中：

X——试样中蛋白质的含量，单位为g/100gV1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为ml；V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为ml；c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为mol/L；0.0140——1.0mL硫酸或盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量m——试样的质量，单位为g；

V3——吸取消化液的体积，单位为ml；F——氮换算为蛋白质的系数，各种食品中氮转换系数见标准附录A100——换算系数五、注意事项

加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。