基因工程的基本操作程序课件

1.2基因工程的基本操作程序2023/8/1011.2基因工程的基本操作程序2023/8/11基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定（前提）（核心）（关键）（保证）基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P9第一和二两段也可以是一些具有调控作用的因子一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是__________一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库（先建立基因文库，再从中筛选；）一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.基因文库提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库3、构建基因文库（1）构建基因组文库提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶（2）构建cDNA文库3.构建基因文库某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较注意：基因文库4、从基因文库直接获取目的基因怎样从基因文库中获取目的基因呢？（1）获取目的基因的根据：如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；

基因翻译产物蛋白质等特性。4、从基因文库直接获取目的基因怎样从基因文库中获取目的基因呢4、从基因文库直接获取目的基因（2）用DNA探针从基因文库中获取目的基因不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。4、从基因文库直接获取目的基因（2）用DNA探针从基因文库中基因工程的基本操作程序ppt课件基因工程的基本操作程序ppt课件4、从基因文库直接获取目的基因（2）用DNA探针从基因文库中获取目的基因不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。也可以用PCR方式从基因文库中获取目的基因4、从基因文库直接获取目的基因（2）用DNA探针从基因文库中为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的构建基因文库是获取目（二）、利用PCR技术扩增目的基因（二）、利用PCR技术扩增目的基因（二）、利用PCR技术扩增目的基因前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。以便合成引物。原理：利用DNA双链复制原理（二）、利用PCR技术扩增目的基因前提：有一段已知目的基因的

过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃在Taq酶作用下，合成互补的新DNA链变性退火延伸注意：双链DNA中，G和C比例越高，DNA变性温度越高。过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链（二）、利用PCR技术扩增目的基因（二）、利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制有一段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物耐热的DNA聚合酶（Taq酶）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增二、利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。

c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板b、PCR技术DNA复制过程DNA变性（90～95℃）→退火（复性55~60℃）→子链延伸（70~75℃）→重复循环DNA复制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同点原则碱基互补配对条件模板、原料、能量、酶、引物等不同点解旋方式氢键在高温下断裂，双链全部解开解旋酶催化氢键逐步断裂场所体外主要在细胞核中引物DNARNA酶热稳定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶等结果在短时间内形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技术扩增目的基因2023/8/1020PCR技术DNA复制过程DNA变性（90～95℃）→退火（复33.(8分)请回答基因工程方面的有关问题：（1）利用PCR技术扩增目的基本因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。33.(8分)请回答基因工程方面的有关问题：“汉水丑生的①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为

。②在第

轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。15/16三“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所模板DNA95℃模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72℃TPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束基因工程的基本操作程序ppt课件（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。第一组：①_______________________________________②_____________________________________引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效引物I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）人工化学合成法：（三）、人工合成目的基因（在DNA合成仪中合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA基因比较小，核苷酸序列已知目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA反转录合二、基因表达载体的构建——基因工程的核心目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建——基因工程的核心目的：使目的基因在受原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区：能转录，编码蛋白质非编码区：不编码蛋白质,能调控遗传信息表达2023/8/1033原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区启动子终止子编码区上游编码区下游内含子外显子与RNA聚合酶结合位点编码区：非编码区：外显子：内含子：能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列2023/8/1034真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区启动子终止子编码区上非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核基因的结构2023/8/1035非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码2023/8/1036原核细胞真核细胞不同点编码区是编码区是间隔的、_____的都2、表达载体的组成启动子终止子目的基因标记基因等2、表达载体的组成质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种3.过程:质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个切口DNA连接酶重组DN①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DN1、构建重组质粒时，需用

切割含目的基因的DNA和载体。目的是。切割含目的基因的DNA和载体并非只能用同一种限制酶。2、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？3、目的基因与载体成功连接的基础是什么？4、目的基因的插入位点不是随机的。目的基因的插入不能破坏载体上自身需要的基因片段，以及其上的标记基因，且插入在启动子和终止子之间。5、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差异。1、构建重组质粒时，需用切割切割含目基因工程载体的构建需要考虑的因素：（1）基因的特点：若来自动物的目的基因含有内含子，不能用于转基因植物；若基因产物是糖蛋白，该基因在原核生物中的表达蛋白不具备天然的活性；（2）要选择强启动子或组织特异性启动子；（3）要有选择标记基因；基因工程载体的构建需要考虑的因素：（1）基因的特点：若来自动三、将目的基因导入受体细胞（一）转化（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞（一）转化（二）方法将目的基因导1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法

①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。1、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染双子叶植物和裸子植物③过程：④优点：经济、有效③过程：④优点：经济、有效（2）基因枪法（3）花粉管通道法（2）基因枪法2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：2、将目的基因导入动物细胞3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：

大肠杆菌大肠杆菌四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物归纳步骤归纳步骤（二）、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:

用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA（二）、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了m思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；2023/8/1053思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。2023/8/1054（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；2023/思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。2023/8/1055思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些