第十章动物基因工程课件

第十章

动物基因工程现代生物技术（生物工程）的概念

建立在分子遗传学、生物化学、微生物学以及化学工程、计算技术等基础上的现代生物技术，是20世纪后半叶蓬勃发展起来的新技术领域，为人类保健、农牧业、食品工业、环境保护等提供了强大的发展动力。

现代生物技术的内涵非常广泛并不断发展，目前主要有：基因工程·细胞工程·蛋白质工程·酶工程·糖工程·环境生物工程·转基因动物·克隆动物·基因治疗·生物制药·生物信息学·高级生物传感器1第十章

动物基因工程现代生物技术（生物工程）的概念

第一节 基因工程概述一、重组DNA技术的建立

1972年美国斯坦福大学的Berg获得了SV40和λDNA重组的DNA分子

1973年美国斯坦福大学的Cohen等人，将大肠杆菌R6-5质粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出两种抗性的细菌。

Cohen与Boyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNA。2第一节 基因工程概述一、重组DNA技术的建立

1972

BergP、Cohen和Boyer等人的工作是世界上第一次实现DNA体外重组，建立了第一个基因克隆系统（质粒—大肠杆菌），导致了一个全新的生物技术学科和产业——基因工程的诞生。

基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景3

BergP、Cohen和Boyer等人的工作是世

基因工程的概念

○基因工程是一种DNA重组技术,在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状

○基因工程的操作程序：获取目的基因——目的基因与载体构建重组DNA分子——重组DNA分子转移至受体细胞——转化细胞的扩增、鉴定和筛选4基因工程的概念

○基因工程是一种DNA重组技术第二节

工具酶一、限制性内切酶

（一）分类与命名

○酶有几千种，分为6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。

○基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等水解酶分为内切酶和外切酶

○内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。5第二节

工具酶一、限制性内切酶

（一）分类与命名

限制性内切核酸酶

(restrictionenzymes)能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。功能：降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。6限制性内切核酸酶

(restrictionenzymes)限制性内切酶分类第Ⅰ类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性第Ⅱ类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)（EcoRⅠ）另一类酶，如SmaⅠ，它们酶切DNA双链后，产生的DNA片段具有平齐末端(bluntends)7限制性内切酶分类第Ⅰ类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端）8限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端）8EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组9EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组9平齐末端（SmaⅠ）10平齐末端（SmaⅠ）10限制性内切酶的命名属名＋种名＋菌株类型＋发现的顺序11限制性内切酶的命名属名＋种名＋菌株类型＋发现的顺序11限制性内切酶的主要用途

○重组DNA分子

·匹配末端的连接同一种酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端；或不同酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端，可在连接酶作用下连接为重组DNA分子。

·平端连接可直接连接，但效率较低。

·不匹配黏端的连接先补平(Klenow)或修平(S1)后再连接。

○绘制物理图谱（限制性内切酶图谱）12限制性内切酶的主要用途○重组DNA分子

·匹配

二、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶的类型

○依赖DNA的——DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、修饰的T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶。○不依赖DNA的——末端转移酶○依赖RNA的——反转录酶13二、DNA聚合酶13DNA聚合酶的特性14DNA聚合酶的特性14

三、DNA连接酶

·该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平端双链DNA片段的5’-P与另一也带相应缺口的DNA片段的3′-OH连接起来

四、甲基化酶、核酸酶等（从略）15三、DNA连接酶

·该酶的用途是将带匹配

第三节

基因工程载体

○载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具

○克隆载体——克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加

○表达载体——将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质

○插入型载体——将外源基因或DNA插入其中

○置换型载体——切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。16

第三节

基因工程载体

○载体是指将外载体必须具备的条件

·能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子·载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个内切酶位点）·克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子·载体上要有报告基因或选择标记基因·在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点17载体必须具备的条件·能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重

一、质粒载体

○质粒是一种存在于细菌细胞质中，独立于细菌染色体而自然存在的，在细菌体内能进行自我复制、易分离和导入的DNA环状双链分子

○质粒大小相差很大（从小于1Kb到大于500Kb），都有一个复制起点。

○亲缘关系密切的两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定地共存，称为质粒的不亲和性。

○只能在特定宿主细胞中复制的称为窄宿主范围质粒；可以在多种宿主细胞中复制的称为广宿主范围质粒。18

一、质粒载体

○质粒是一种存在于细菌细胞质

○严谨型质粒——每个细胞中有1-2个拷贝，具有自身传递能力，分子量大。

○松弛型质粒——每个细胞中有10-100个拷贝，不具有自身传递能力，分子量小。基因工程常用此类质粒。○常用的质粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等。○质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段。19○严谨型质粒——每个细胞中有1-2个拷贝，具有自身传递

第四节

目的基因的获取

○利用PCR克隆目的基因

·反向PCR（inversePCR,I-PCR）克隆基因组DNA片段

I-PCR是根据已知序列扩增其旁侧序列的方法。所用的引物与正常的PCR引物方向相反

·反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)合成cDNA

·RT-PCR是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，再复制成双链DNA20第四节

目的基因的获取

○利用PCR克

二、基因组文库的构建与基因克隆

○基因组文库的概念

·需要将某种生物全部基因组的遗传信息，儲存在可以长期保存的、稳定的重组体中，以便需要时即可应用。这种保存基因组信息的材料，称为基因文库。

·当需要某一目的基因时，就可在基因组文库寻找，一般采用核酸探针的方法，从文库中“钓出”某基因。21二、基因组文库的构建与基因克隆

○基因组文库的概念

○基因组文库的构建

1．DNA片段的制备分离纯化基因组DNA——用限制酶完全酶切或部分酶切

2．DNA片段与载体的连接选择合适的载体

3．体外包装和基因组文库的扩增包装入噬菌体进行感染，或转化使质粒DNA进入细胞

4．重组DNA的筛选和鉴定22

○基因组文库的构建

1．DNA片段的制备

三、基因的人工合成

○如果已知某基因的核苷酸序列，或者通过基因产物的氨基酸序列推导出基因的核苷酸序列，就可将单核苷酸或寡核苷酸一个一个缩合起来，成为一个基因的核苷酸序列。连接的两个分子各有一端被封闭。

○先合成分别属于双链序列的8-12碱基的片段，两个片段的对应部分配对后留有粘性末端，第三个片段再连接上去，不断延伸直至全部合成23三、基因的人工合成

○如果已知某基因的核苷酸序列，

第五节DNA体外重组和基因转移

一、载体与基因的连接

常用的连接方式有：粘性末端连接法、平头末端连接法、人工接头连接法、同聚物加尾连接法。

（一）粘性末端连接法

○相同限制酶切位点连接法

同一的限制酶切割不同DNA会产生相同的粘性末端，在连接酶的作用下，不同DNA相同的粘性末端形成磷酸二酯键而连接起来24

第五节DNA体外重组和基因转移

24

（二）外源基因向真核细胞转入

1．借助于载体的基因转移

主要是以重组的动物病毒和逆转录病毒直接感染受体细胞，把外源DNA引入

○逆转录病毒的特点：

·病毒基因组为单链RNA，感染期间为双链DNA

·DNA能整合进细胞并复制

·DNA在动物通过生殖细胞传递到下一代；·带有对复制有重要意义的基因：gag（结构蛋白）、pol（DNA聚合酶）、env（被膜糖蛋白）25

（二）外源基因向真核细胞转入

1．借助于

2．不需载体的基因转移

○磷酸钙沉淀法

·细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力

·将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐，生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养液中

·由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉淀物进入细胞，DNA释出后先进入细胞质、再进入细胞核，整合到受体细胞的染色体上26

2．不需载体的基因转移

○磷酸钙沉淀法

○脂质体介导法

·脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构

·形成囊状结构可将DNA包在其中

·带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达到基因转移的目的

○血影细胞介导法

·血影细胞：哺乳动物细胞溶血，使血红蛋白大量逸出，最后成为仅有被细胞膜包被的细胞核结构

·血红蛋白大量逸出时，外源DNA也容易进入。让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而使外源DNA导入受体细胞

○电转移法

受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中，经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞（或受精卵）27 ○脂质体介导法27

第六节

重组体的鉴定与筛选

一、遗传检测法

（一）抗体筛选法

利用载体上的抗性基因对阳性克隆作初步的筛选。如pUC19质粒中有Ampr基因，为宿主细胞提供氨苄青霉素抗性。

将转化后的细胞涂布在含氨苄青霉素的培养基中培养——

·大部分受体细胞没有外源DNA导入，其本身又没有Ampr基因，所以在培养基中不能生长。

·在含有外源DNA的受体细胞中，只有含有质粒自连或者质粒与目的DNA形成重组子的受体细胞由于含Ampr基因，能在培养基中生长。

28

第六节

重组体的鉴定与筛选28

（二）插入失活选择法

·当外源DNA插入到载体的某一基因中间时，该基因就不能表达，这种现象称为插入失活。

·例如，pBR322有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶位点，如果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致Tetr基因失活。

·将转化后的细胞分别培养在含氨苄青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。29

（二）插入失活选择法

·当外源DNA插基因的插入失活效应30基因的插入失活效应30

三、核酸分子鉴定法

○Southernblot(Southern印迹试验)

原理——利用硝酸纤维薄膜（或滤纸、尼龙膜）具有吸附DNA的功能，先作DNA凝胶电泳，并将凝胶电泳的DNA区带吸附到膜上，然后在膜上进行同位素标记探针与被测样品只间的杂交，在通过放射自显影对杂交结果进行检测。

31

三、核酸分子鉴定法

○Southernbl

四、序列分析法

测序分手工测序和自动测序。

·手工测序有双脱氧测序法和化学测序法，前者广泛使用。

·自动测序可用全自动化的DNA序列测序仪准确快速测定DNA序列。32四、序列分析法

测序分手工测序和自动测序。

·手

○DNA自动测序

·DNA自动测序仪根据Sanger的酶促反应原理，用4种荧光染料标记引物，这4种荧光在受到激光照射时会发出可以辩别的不同颜色。

33

○DNA自动测序

·DNA自动测二、转基因动物技术的主要步骤获取外源目的基因外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物34二、转基因动物技术的主要步骤获取外源目的基因34三、

转基因动物的技术路线

经典的技术路线

目的基因

显微注射

已交配的取出

移植受体动物妊娠

供体动物受精卵输卵管转基因动物

缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。35三、

转基因动物的技术路线

经典的技术路线

35

转基因动物的技术路线(续)

整合胚胎移植的技术路线转基因动物受体动物子宫

目的基因非手术

胚胎移植

体外受精

体外培养多细胞胚胎

检测整合外源基因

卵子受精卵或囊胚的胚胎

精子

优点：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。36

转基因动物的技术路线(续)

整合胚胎移植的技术路线36

转基因动物的技术路线（续）核移植（克隆）的技术路线

目的基因转基因动物

导入

动物胎儿成纤维细胞妊娠

取核

动物去核重组的体外培养囊胚期胚胎移植

卵细胞受精卵胚胎受体动物子宫

特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。37

转基因动物的技术路线（续）核移植（克隆）的技术路线

转基因动物的技术路线（续）整合卵受精的技术路线：

目的基因转基因动物

导入

逆转录病毒妊娠

精子

感染

体外受精

胚胎移植

卵母细胞成熟卵细胞囊胚受体动物子宫

特点：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。38

转基因动物的技术路线（续）整合卵受精的技术路线：

四、目的基因的制备和转基因的方法

目的基因的制备

·目的基因的获得

逆转录合成法化学合成法PCR扩增法

·目的基因的扩增

通过载体在宿主中克隆通过PCR扩增目的基因转基因动物的方法

·显微注射法·生殖细胞载体法·胚胎干细胞法·病毒载体法39四、目的基因的制备和转基因的方法目的基因的制备

·目的基因显微注射法

显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。

显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入方法。其缺点是：整合效率低（小于1%）；不能定点整合，影响基因表达和遗传稳定性；方法复杂、设备昂贵。

40显微注射法

显微注射法是在显微注射仪生殖细胞载体法

有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。

精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。

此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。

41生殖细胞载体法

有体外和体内转染生殖细胞的两胚胎干细胞介导法

胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）是从胚泡内细胞团分离得到的多潜能细胞。

将外源基因导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表现良好的细胞，将这些细胞注射到小鼠胚泡腔中，部分ES细胞可与内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。

在嵌合过程中，带有外源基因的ES细胞可能进入生殖系，在经杂交育种可得到纯合体，即为所需的转基因小鼠。

42胚胎干细胞介导法

胚胎干细胞（embryonics病毒载体法

细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。动物病毒载体是较理想的真核基因工程载体。

病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。常用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等。43病毒载体法

细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运五、

转基因动物的应用研究改良动物经济性状的尝试

试图通过转移单个基因改良动物经济性状的研究，至今仍未见成功的报道，尚需对性状表现的生化代谢途径，有关基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表达、组织特异性表达等进行深入的研究。乳腺生物反应器的研究

1987年，Gordon首次报道小鼠乳腺中表达tPA蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功报道实例已有10多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子Ⅷ、蛋白质C等药用蛋白。国外经济学家预期，10年后，转基因动物生产的药物销售额超过250亿美元。44五、

转基因动物的应用研究改良动物经济性状的尝试

试图通基因药物生产基因药物生产第一阶段是细菌基因工程，第二阶段是动物细胞基因工程，第三阶段是转基因动物—乳腺生物反应器。具有以下特点：

⑴乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；

⑵乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白250—300Kg，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代换成医用蛋白，产量十分可观。

⑶乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性接近天然产品。

⑷在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖生产群体。45基因药物生产基因药物生产第一阶段是细菌基因工程，第二阶段是动六、转基因动物研究存在的问题

转基因动物的低效性转入基因引起完整基因突变转入基因表达混乱病毒转基因对宿主的影响转基因动物模型与预期不符乳腺反应器的完善转基因动物及产品的认可46六、转基因动物研究存在的问题转基因动物的低效性46第九节基因治疗人类遗传疾病有5000多种，基本上不可能用常规的方法治疗。个别病例只能对症疗法，减轻症状，但不能治愈。基因治疗可能是唯一的方法。基因治疗（genetherapy）是向靶细胞导入外源基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗遗传病的目的。1990年，美国国家卫生院（NIH）重组DNA咨询委员会（RAC）批准治疗腺苷脱氨酶（ADA）的临床治疗方案，2个病例症状有改善。1991年上海复旦大学与第二军医大学合作用基因疗法治疗血友病B的临床试验，患者症状有所改善47第九节基因治疗人类遗传疾病有5000多种，基本上不可一、基因治疗的类型1.基因调控治疗

从基因水平调控缺陷基因的表达，以达到改善症状的目的

镰型细胞贫血症是因珠蛋白的β链基因突变，产生不正常的血红蛋白所致。用5—氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而关闭的γ基因重新开放，产生HbF以代替HbA。

用具有抑制基因表达的反义RNA，或能切割RNA的核酶（ribozyme），阻断基因的表达。在肿瘤的治疗上，可以在基因水平上抑制肿瘤细胞基因的恶性表达和引导肿瘤细胞逆转。48一、基因治疗的类型1.基因调控治疗

从基因基因治疗的类型（续）2.基因矫正治疗

基因增补——将正常基因导入患者的体内，补偿缺陷基因的功能。

基因替换——以正常基因取代变异的基因。

基因修复——对异常基因进行原位的特异性修复。

按矫正基因的类型分为两种基因治疗：

·生殖细胞基因治疗——对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。1987年，成功治疗小鼠颤抖症、免疫缺陷症、地中海贫血症等。

·体细胞基因治疗——以体细胞为受体细胞，不影响下一代。常用的是细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因修饰，再将其输入体内。49基因治疗的类型（续）2.基因矫正治疗

基因二、基因治疗的条件·对导入的基因及其产物有详尽的了解；

·外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表达；

·不能使受治细胞基因组及表达调控受影响；

导入基因方法安全，载体对靶细胞无害；

三、基因治疗的原则

·对象是病情严重、预后极差、别无他法的患者；

转移的基因被克隆；

·无需高水平的表达和精确定量控制就有治疗效果；

·靶细胞获取或回输安全；转移基因的表达对细胞微环境无严格的特异性要求。50二、基因治疗的条件·对导入的基因及其产物有详尽的了四、基因疗法的步骤

目的基因的选择根据基因治疗的类型选择相应的目的基因（增补、替换、添加）基因载体的构建：使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达受体细胞的选择：容易分离获取，在体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞等。51四、基因疗法的步骤目的基因的选择根据基因治疗的类型五、基因治疗的应用治疗恶性肿瘤

例如，将已导入IL—2基因的TIL细胞回输给病人，启动自身免疫，治疗黑色素瘤。美国已批准8种基因治疗方案。

治疗艾滋病用射线照射已导入HIV基因的成纤维细胞，细胞停止分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人，能激活免疫系统，杀伤HIV感染细胞。治疗家族性高胆固醇血症（FH）

这是肝细胞低密度脂蛋白（LDL）受体基因混乱造成的遗传病，将LDL基因导入病人离体培养的肝细胞中，然后经导管注入门脉循环的血液中，进入肝细胞后表达相应的功能蛋白。52五、基因治疗的应用治疗恶性肿瘤52基因治疗的应用（续）治疗先天性免疫缺陷综合症

病人因缺少腺苷脱氨酶基因（ADA）导致T、B淋巴细胞发育不完全，功能障碍，造成严重免疫缺陷。将正常ADA基因经转录病毒转染进入白细胞，回输患者体内，ADA基因表达正常，患者ADA达正常值的25%。治疗B型血友病：