EMSA实验方案翻译

EMSA试验试验设计ControlSystemTestSystem10个，“#number”表示泳道序号。Table1.Controlreactionsfortheexpectedresults.ComponentFinalAmountControlReactions#1#2#3UltrapureWater----12μl11μl9μl10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl100mMMgCl21μg/μlPoly(dI·dC)5mM50ng/μl1μl1μl1μl1μl1μl1μl1%NP-400.05%1μl1μl1μlUnlabeledEBNADNA4pmol--------2μlEBNAExtract1Unit----1μl1μlBiotin-EBNAControlDNA20fmol2μl2μl2μlTotalVolume----20μl20μl20μlTable2.BindingreactionsfortheTestSystem.ComponentFinalReactionsAmount#4#5#6#7 #8#9#10----5L1D5L6DW0 PPP0P3UltrapureWater----10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl2μl 2μl2μl2μl1μg/μlPoly(dI·dC)50ng/μl1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlOptional:50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlOptional:1%NP-400.05%1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlOptional:1MKClOptional:100mMMgCl2Optional:200mMEDTA5mM1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlUnlabeledTargetDNA4pmol----------------------------ProteinExtract2μg----BiotinEnd-LabeledTarget20fmolDNATotalVolume----20μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl进一步试验UnlabeledTargetDNA(coldprobe)特异性竞争结合，排解非特异性结合的可能；最终在与探针结合的蛋白的位置凝胶切下测序。试验预备试剂2020次，并过夜浸泡，使用过程避开穿插污染。500ml5TB〔0.22μm水系滤头过滤：Trizma(Tris) 27gBoricacid 13.75g0.5mol/LEDTA-Na+(pH8.0)…10ml或直接加NaEDTA·2HO 1.86g2 2400ml500ml0.22μm水系滤器过滤；25ml40%Acrylamid〔丙烯酰胺甲双叉丙烯酰胺：1﹕：Acrylamide 9.5gBIS 0.5g10ml20ml，0.45μm水系滤器过滤，于棕色瓶中4℃保存；显影液和定影液：依据试剂说明配制，可用无特别处理的量筒配制，可重复使用3~4次；1ml10%AP〔过硫酸铵；不行使用过旧的〕:AP 0.1g去离子水 1ml4℃，2周内有效；50ml5MNaCl：NaCl 14.61g去离子水 40ml50ml，高温高压灭菌，4℃保存；50ml0.5MEDTA(pH8.0)：NaEDTA·2HO 9.305g2 2去离子水 40ml+NaOH1g调整pH8.050ml，高温高压灭菌，室温保存；50ml1MTris-HCl(pH7.5)：Trizma(Tris) 6.055g去离子水 40ml+3.5mlHCl，冷却至室温，调整pH7.550ml，高温高压灭菌，室温保存；50%Glycero〔配胶用：Glycerol 1ml去离子水 1ml0.22μm水系滤器过滤；1%NP-40；TEMED；EBNAControlSystemcomponents；TestSystemsamples；UltrapureWater；设备仪器100m、500ml量筒；电泳及转膜设备〔包括冰袋和泡沫箱；大摇床；紫外超净工作台；10ml 小烧杯；6个大培育皿；尼龙膜；滤纸；水浴锅；250ml锥形瓶1个；保鲜膜；暗盒；X-射线胶片；0.45μm和0.22μm滤头；探针退火接头退火流程：〔Oligo进展退火连接，也可以选择其他商业供给的高亲和柱纯化或HPLC〕A：为了建立接头退火反响体系，需将以下成分混合：〔需依据Oligo针的量〕体系成分 终浓度OligonucleotideOligonucleotide1100nmol/mlOligonucleotide2 100nmol/ml1010×退火缓冲液*1×DEPC-Treatedwater 适量*10×退火缓冲液成分：100mMTris-HCl(pH7.5),10mMEDTA,1MNaClB：将oligo溶液放在65℃或者更高温度下孵育10min〔保持恒定温度和时间至关重要oligo溶液取出，并在室温下缓慢冷却〔1~2小时。C：将连接好的接头于-20℃保存。试验步骤PrepareandPre-RunGel制胶：按Table3试剂表制胶。Table3.6%Polyacrylamideminigel.Component Volume5×TBE(5×TBE(过滤)1ml40%Acrylamide 1.65ml50%50%Glycerol(过滤)0.5mlTEMED 10μlUltrapureUltrapureWater6.78ml10min10%10%AP60μlTotalVolume 10ml30min0.5×TBE电泳缓冲液。预电泳：0.5×TBE5min，观看无漏，则连续加缓冲液至没过金属线；100V，13~15mA预电泳〔可直接调整电流，不调电压〕至电流恒定，30~60min。同0.5×TBE4℃冰箱预冷，为电转运作预备。PrepareandPerformBindingReactions①冰上解冻EBNAControlSystemcomponentsTestSystemsamples〔不要涡旋和用手捂热，使用时再室温解冻EBNAExtrac。②依据Table1Table220μl20min。5μl5×LoadingBuffer20μl反响体系，上下吹打数次，充分摇匀，不要旋涡或猛烈混匀。ElectrophoreseBindingReactions20μl到胶孔中，翻开电流〔设定为100V为8×8×0.1厘米凝胶〕，2/33/46％凝胶中游离的biotin-EBNAControlDNAduplex位于溴酚蓝迁移后面。ElectrophoreticTransferofBindingReactionstoNylonMembrane①0.5×TBE10min。②依据“〔底〕海绵+2层+凝胶+尼龙膜+2层+海绵”将膜等放在一个干净的电泳转移槽中〔避开使用已被用于免疫印迹海绵，加0.5TBE电泳缓冲液至没过海绵。③380mA〔~100V〕45~60min，转运过程预备交联设备，并将BlockingBuffer和4×WashingBuffer50℃水浴至全部颗粒溶解。④完成后，将膜的溴酚蓝一侧〔与凝胶相贴一面，即正面〕朝上放置于干纸巾上。在凝胶中不应有任何残留的染料〕不要让膜枯燥，马上进展下一步。Cross-linkTransferredDNAtoMembrane10cm10min。DetectBiotin-labeledDNAbyChemiluminescence①BlockingBuffer4×WashingBuffer50℃之间使用，保持全部的颗粒留在溶液中。SubstrateEquilibrationBuffer4℃和室温使用之间。②封闭膜：〔以下操作均保持膜正面朝上20mlBlockingBuffer45rpm15min。③预备conjugate/blockingsolution：20mlBlockingBuffer中参与66.7μlStabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate〔1:300稀释。④倒出膜中的BlockingBufferconjugate/blockingsolution。45rpm15分钟；1×washsolution：40ml4×WashBuffer+120mlultrapurewater。⑤膜转移到一个培育皿，用20ml1×washsolution洗，45rpm5min，共洗膜4次。30mlSubstrateEquilibrationBuffer，45rpm5分钟；关灯：预备SubstrateWorkingSolution：6mlLuminol/EnhancerSolution+6mlStablePeroxideSolution。暴露在阳光下或任何强光都会破坏WorkingSolution，应保存在棕色瓶并避开长时间暴露在强光下；短期暴露于通常的试验室灯光不会破坏溶液。⑦将膜从SubstrateEquilibrationBuffer中取出，用纸巾留神地吸