细胞生物学实验手册

细胞生物学试验手册细胞生物学试验手册10细胞生物学试验手册授课教师:毛晓霞(一)成绩试验成绩构成分数评分细则备注预习报告3分3分验仪器与材料、留意事项课堂提问2分2分项试验结果10分10分√8分,操作2分根本操作标准、整理试验台试验报告15分一、内容完整,对试验六试验结果与结果分析透彻结果分析透彻A+15 分析、七作业、分八思考题三、内容构成不完整B10分四、凡抄袭她人与被抄袭觉察者一律C5分130%,即30分;取七个试验的平均成绩为试验最终成绩2、分组名单:AB两班,5组,6人3、请假:辅导员签字的假条+提前一天请假(二)试验要点一、试验目的1、了解光学显微镜构造原理并娴熟把握其操作方法;2、把握显微摄影技术操作流程3二、试验原理显微镜的放大效能就是由其照明系统所使用光的波长与透镜系统的数值孔径打算,缩短使用的光波长或增加数值孔径可以提高区分率。可见光的光波振幅较窄,因此使用较短波长的紫外光作为光源系统,可以提高区分率。三、试验内容1、双目显微镜的操作标准:2、NIKON80i显微摄影系统的操作流程3、胶片放大洗印技术流程4、局部大型仪器设备介绍荧光显微镜Fluorescencemicroscope暗视野显微镜darkfieldmicroscope相差显微镜微分干预差显微镜倒置显微镜inversemicroscope显微操作仪透射电子显微镜TEM四、作业1、双目显微镜操作流程标准五、思考题1、暗视野显微镜的定义与应用2、相差显微镜的定义与应用:1、把握血涂片的制备技术2、生疏血液中红细胞与各类白细胞的形态二、试验原理:将血液样品制成单层细胞的涂片标本,经瑞氏－吉姆萨染液染色后,不同白细,酸性粒细胞的颗7橘红色,中性粒细胞的颗粒呈粉红色。依据细胞中颗粒的颜色、大小及多少,再结合细胞的大小及细胞核的形态,就可以将白细胞进展分类计数。三、试验步骤1、消毒与取血消毒,使血流通畅;再用酒精消毒采血针与取血部位(如指尖)、取血待酒精干后,刺破皮肤,使血自然流出,勿挤、2、推片取一块边缘光滑的载片做推片、将其一端置于血滴前方,向后移动到接触血30°～40°角,向另一端平稳地推出,快速在空气中摇,使之自然枯燥、3、染色滴,1分钟,B染液滴加A液上面(A2－3倍),5－10冲掉,用吸水纸吸干,自然枯燥后,即可镜检观看4、观看、玻片的清洗:使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片外表,以保持玻片清洁,枯燥,中性,无油腻、细胞染色对氢离子浓度格外敏感,在染色过程中玻片必需化学清洁,配制瑞氏染液必需用优质甲醇,稀释染液必需用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则各种细胞染色反响特别,致使细胞的识别困难,甚至造成错误、染色时间与染液浓度,室温凹凸,细胞多少有关、染液越淡,室温越低,细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体状况而定、特别就是更换染料时必需经试染,摸索最正确染色条件、染液不行过少,以防蒸发枯燥染料冷静于血片上难冲洗干净、冲洗时应用流水将染液冲去,不能先倒掉染液,以免染料冷静于血片上、测微尺的使用,由目镜测微尺与镜台测微尺组成,两尺协作使用、计算细胞、细胞核体积的公式:V=4/3πr3(r为半径)V=4/3πab2(a、b为长、短半径)N／D=Vn／(Vc—Vn)(Vn为核的体积,Vc就是细胞质的体积)五、作业题1、制备一张血涂片,观看并描述其中各类血细胞的形态特征并计算出平均值六、思考题,一张好的血涂片有哪些特征？一、试验目的了解细胞膜的外表构造;了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞膜的速度二、试验的原理1、细胞凝集反响,蛋,糖蛋白与糖脂分子伸至细胞外表的分枝状寡糖链在质膜外表形成细胞外被(又称为糖萼)。凝集素(1ectin)就是一类含糖的(少数凝集素例外)并能与糖进展专一性结合的蛋白质,它具有凝集细胞与刺激细胞分裂的作用。凝集素促使细胞凝集主要就,且参与与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反响。2、细胞膜的渗透性7～8nm,由脂类与蛋白质组成,还有一类碳水化合物,我们知道糖类物质也属于碳水化合物的范围。细胞膜把细胞包裹起来,使细胞能够保持相对的稳定性,维持正常的生命活动、它最重要的特性就是半透性,或称选择渗透性,对进出入细胞的物质有很强的选择透过性,它可以选择性的让某些分子进入或排出细胞。这就是细胞膜最根本的一种功能、假设细胞丧失了这种功能,细胞就会死亡、三、作业题试管编号就是否溶血时间结果分析5ml氯化钠+0、5ml试管编号就是否溶血时间结果分析5ml氯化钠+0、5ml稀释鸡血5ml氯化铵+05ml稀释鸡血5ml醋酸铵+05ml稀释鸡血5ml硝酸钠+05ml稀释鸡血5ml草酸铵+05ml稀释鸡血5ml硫酸钠+05ml稀释鸡血5ml5ml葡萄糖+05ml稀释鸡血5ml甘油+0、5ml稀释鸡血5ml乙醇+0、5ml稀释鸡血5ml丙酮+05ml稀释鸡血四、思考题参与凝集素的细胞会分散在一起,参与何种物质能抑制细胞凝集？二、荧光显微镜使用步骤1.开电源按预置开关、将ND8,ND32,NCB11推入光路转换杆,使光路布满双目镜筒转动激发方式转换盘放空位处将聚光镜升到最高位全部开启视场光阑与视场光阑810X放置标本并将要观看局部置于光路中对标本调焦调整视度与瞳孔距离、聚光镜聚焦与对中、转换到所需的物镜观看标本每次转换物镜时,都要调整视场光阑与孔径光阑(视场光阑:调到刚好外切视场;孔径光阑:物镜数值孔径(N、A7080%)观看完毕后,关闭电源、荧光观看111。降低聚光镜或移开聚光镜并在它位置装上遮光管。关闭显微镜电源开关。关闭光闸与阻断落射照明光组。将要使用的激发法相应荧光块移入光路。完全翻开落射照明装置的视场光阑与孔径光阑翻开落射照明装置光源的电源开照看后翻开光闸,对中照明灯10X放入标本并将要观看局部移入光路中。对标本调焦。将落射荧光装置的视场光阑对中心转换到需要的物镜并观看标本。用落射荧光装置的ND调整视场光阑使其刚好外切视场。用孔径光阑调整图像亮度,使用孔径光阑之前,先完成它的对中。使用油浸物镜时,在标本与物镜间滴入浸油。13.回复到明场显微术关闭落射照明装置的光闸并阻断落射荧光光线。旋转激发法转换盘将无荧光滤光块的位置移入光路假设没有装上聚光镜装上聚光镜,然后进展聚光镜的对中与调焦12翻开显微镜电源开关转到透射光源14.完成观看后关掉全部电源开关三、叶绿素的自发荧光与叶绿体的间接荧光原理激发态,从激发态回到基态时,就能在极短的时间内放射出比照耀光为自发荧光),如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光,但它吸取荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光),如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本试验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进展观看。吖啶橙(AcridineOrange,AO)就是一种荧光色素,其激发滤光片488nm515nmDNARNA存在差异,可发出不同颜色的荧光(即着色特异性),这就是由于DNARNA合度低,能与荧光物质结合的位置多,故发红色荧光。四、作业题四、作业题1、依据荧光观看结果,绘制菜叶的构造模式图。2、概述滤镜系统的选用原则。五、思考题10、35mol/L氯化钠？试验五DNAFeulgenFeulgen

Carnoy12h↓60℃1mol/LHCl8min↓3↓Schiff30min↓3~5↓3↓↓三、作业题1、绘图表示Feulgen四、思考题1、总结Feulgen2、在稀盐酸水解后,为什么要用亚硫酸水进展洗片？一、石蜡切片操作根本过程:取材,固定,脱水,透亮,透蜡,包埋,切片,贴片,染色,透亮,封藏等步骤。取材以下几点就是必需留意的。的局部;动麻醉,常用的麻醉剂有氯仿与乙醚,或将动物杀死后快速取出所需要的组织。取材必需颖,这一点对于从事细胞生物学争论尤为重要,应当尽可能割取生活着的组织块,并随即投入固定液。切取材料时刀要锐利,避开因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应当小而薄不超过2mm,大小不超过5×5mm2。固定固定剂的作用,至于其她成分如脂肪与糖,在一般制作时不加考虑,如要观看这些物质,可用特别的方法将其固定下来。固定剂的作用表现在对穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小,都依所固定的外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必需具备的特征就是:穿透组织的速度快,能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质,不使组织膨胀或收缩以保持原形,硬化组织的程度适中,增加细胞内含物的折光度,增加媒染与染色力气,具有保存剂作用与混合固定剂的划分。简洁固定剂即单一的固定剂,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾与锇酸。其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白;乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白;甲醛、饿酸与重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。简洁固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂可以取得更好的效果。固定时,须留意以下几点:固定剂应有足够的量,一般为组织块体积的10～15倍。醇的溶液中固定几分钟,再移入水溶性的固定液。材料固定后如不马上下沉,可将其中气泡抽出。固定时间依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几十小时,有时中间需要更固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强,作用时间应严加把握,不能过长。定剂由甲、乙两液合并者,确定要在使用前才混合。固定完毕,依据所用固定剂的不同,用水或乙醇冲掉残留的固定剂,以免固定剂形成沉淀,影响以后组织块的染色。脱水,致使在就是脱水的作用。脱水步骤应从低到高以确定的浓度梯度来进展,一般组织从30％乙醇开头,经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水;对于一些松软的组织应从15％开头。脱水时间依据组织的类型与大小而定,45min到1h,70组织作用,放置时间不能过长,另外,脱水必需在有盖瓶中进展,以防存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保存,可参与等量的甘油。透亮组织块用非石蜡溶剂剂与石蜡混合,它取代了脱水剂后,石蜡便能顺当地渗入组织。透亮剂的种类很多,较常用的就是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油与苯胺油等。二甲苯作用较快,透亮力强,但组织块在其中停留过久,简洁收缩变脆变硬,同时假设脱水不净,就会引起不良后果,在应用时必需特别留神。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液,再进入纯二停留时间在30min至2h,在纯二甲苯中应更换2次,总时间则以不超过3h组织则显现透亮状态,如组织中有白色云雾状,说明脱水不净,须返工使用二甲苯透亮时,应避开其挥发与吸取空气中的水分,并保持其无水状态。甲苯的一般性质与二甲苯相像。用法亦同,唯沸点较低,透亮较慢,但不会使组织变脆。透蜡与包埋包埋用的石蜡,熔点在50～60℃之间,应依据片的厚薄与当时的气温条件为52～56℃,植物材料的用54～58℃的;切片薄的用58～60℃的,切片厚的则用52～54℃的;室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺当切片,冬季可用熔点46～48℃的石蜡,夏季可选56～58℃的。透蜡须在恒温箱中进展,恒温箱的温度调整至高于石蜡熔点3度,使经过透亮的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次,透蜡的时间依材料性质而定,一般每次需15～30min。透亮的关键就是,切忌忽高忽低,温度过低石蜡凝固无法渗透,温度过高使组织收缩发脆。包埋就是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法就是:先预备好纸盒(具体折法见图1-3及说明),将熔蜡倒入盒内,快速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待外表石蜡凝固后马上将纸盒按入水中,使其快速冷却凝固,30min后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度,保证组织块与四周石蜡完全以后切片时引起碎裂。切片石蜡块的固着与整修在包埋以后,就可进展切片。包埋好的石蜡块装上切片机进展切片前还须进展固着与整修。固着:一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘,这并使组织块朝外,便于以后快速切出所需的片子。2～3mm的石蜡,而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。切片机与切片刀切片机就是用来作各种组织切片的一种特地设计的周密机械,常的标本台与把握切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动,转动转轮,标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推动确定的距离,组织块上下运动一次,便在刀片上得到一张符合厚度要求的切片。片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上,将刀贴着净。切片方法切片前,将刀口置放大镜下观看,选择刀口平坦无缺刻的局部来进展切削。将所要切的包埋块固定在标本台上,使包埋块外切面与标本夹截面平行,并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋,上好刀片,使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角,包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调整切片要求的厚度,调整至近标本台处,让刀口与组织切面稍稍接触,这时就可以开头切片了。方法就是:右手转动转轮,左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蜡带,待蜡带形成确定长度后,右手停顿转动,持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起,平放于衬有黑纸的纸盒内,留意切片速度不宜太快,摇动转轮用力应均匀,防止切片机震惊厉害引起切片厚薄不均匀,还应留意转动的方向,以防标本台后移而切不到片子。切片完毕,应准时用氯仿将切片机的有关局部擦净。贴片切好的切片必需贴附于载玻片上才能作进一步处理,但就是切片常有细小的横纹,必需经展平后才能贴附,否则影响染色与观看。贴片一般有捞片法与烫板法。捞片法比较简洁,首先将切片分割开,投入到48℃的温水浴中,用涂有甘油蛋白溶液(将鸡蛋一个打破入杯中,去除蛋黄留下蛋白,用(thymol)作防腐用,可保存几个月到一年。)或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水夜后使其彻底枯燥。上去,再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干,并倾斜或用吸水纸吸去水分,最终将载玻片再度放烫板上晾干。干净,不能有油污(检验法:已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水,等物在上面);切片的光面应朝下,否则染色过程中切片简洁脱落。染色组织切片就是无色透亮的,必需进展染色后才能观看到各种微细过脱蜡而再度复水。这方法即为脱水、透亮的逆过程。由于切片格外菲薄,处理的时间大大削减,一般每级停留约2～5min。本次试验承受HE染色法。切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。移入二甲苯与纯酒精(1∶1)混合液中5分钟左右(如经二次二甲苯脱蜡,此步可略)。〔3〕入100％、95％、85％、70％酒精,各级为2～5分钟。最终经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色5～15分钟。水洗玻片上多余染液,0、5～1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻。镜检把握,直至细胞核及核内染色质清楚为止,约数10秒钟。流水冲洗15～30分钟,或者在碳酸锂饱与液中短时间碱化或蓝化,即细胞核呈蓝色。蒸馏水短洗。分钟,假设着色困难,可在每100毫升染液中参与1～2滴冰醋酸,使易着色且不易脱色。在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色,应适当缩短时间。(10)二甲苯透亮(二次),共约10分钟9.透亮染色后的切片须再次经过脱水、透亮。标本经二甲苯透亮后,折射率转变,透亮度提高,使得染上色的部位更清楚地显示出来。10.封藏封藏的目的就是使制成的切片能够永久保存,封藏剂必需能与透亮剂互溶,对染色无影响,折射率近似玻璃与具有粘性的物质,常用的封藏剂有加拿大树胶与中性树胶。苯,在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶,认真掩盖上盖玻片,避开产生气泡,也不得拖动盖玻片,以免将标本破坏大小而定,勿使过多过少。石蜡切片。HE染色的根本原理与染色方法。三、作业题1、每人一张石蜡切片,依据结果给分。四、思考题1、为什么说石蜡的优劣与切片的成败亲热相关？2、恒温在透蜡过程中有何作用？电子显微镜技术一、透射电镜的根本构造透射电镜的根本构造由电子子光学系统6～8级电磁透镜(electronmagneticlenses)及一些光路元件组成的密子枪放射电子波作为“光源”电子就是带电的,所以电磁透镜能够转变电子束的方向。在透射电镜上而下依次称为:第一与其次聚光镜、物镜、中间镜(2～3级)与投影镜透射电镜有浩大的供电系统与真空系统,其中真空系统就是用两种类型的真空泵串联起来,从而获得电镜镜筒中的真空,当电镜启动时,第一级旋转式真空泵获得低真空的二级承受油集中播泵而获得高真空。A B图1A一般光学显微镜 B透射电子显微镜二、透射电镜的根本工作原理“度”(mass-thickness,ρt)反差成像原理作简洁描述。电镜的镜筒内建立强加速场,生物样品常承受60～100kV的加速电压。电子枪阴极发射出的电子在加速场中获得速度与能量,足以透射过50～70nm厚的生物样品并使之成像。聚光镜使来自电子枪的电子束聚焦,并常以散焦的状态泛光式地照耀在样品上。此时,入射电子束与样品原子之间相互作用发生一种物理现象——电子散射(electronscattering)在电子散射过程中,大局部电子直接透过样品,称为直接透射电子(transmissionelectron,TE);有一局部电子在穿透样品过程中不仅转变运动方向,而且可能还损失能量,这些TE称为弹性或非弹性散射电子(elastically scatteredelectrons,inelasticallyscatteredelectrons)。样品构造的“质量—厚度”(ρt)越高,元素的原子序数越大,电子散射越强,TE中的直接透射电子越少,而弹性或非弹性散射电子越多样品下方设计了一个30～80μm的小孔称“反差光阑”(contrastaperture),拦截(吸取)掉散射强的电子,而使直接TE及局部弱散射电子通过。这样,能通过光阑进入成像系统的TE就带有样品上的微细构造信息了。相对ρt高的构造区域,电子散射强,能通过“反差光阑”进入成像系统的TE少,反之,则多。这些TE经过几级成像透镜的放大,由末级投影镜投射到观看室荧光屏上,激发荧光屏发出可见光。TE多,荧屏亮,TE少,荧屏暗。屏点的亮暗程度一一对应着样品微细构造ρt的凹凸。这,生物样品的透射电子显微图就形成了,其图像区分率(resolution)比透射电镜的区分本领(resolvingpower)差一个数量级事实上,透射电镜成像机制比上述简洁得多,尤其对原子尺度的透射电子显微成像,则必需用波的传输理论解释,相关理论与技术属于高区分率电子显微学的范畴,不在此争论。三、使用操作程序翻开电源,抽真空。照明系统(电子枪+聚光镜)合轴。取放样品。图像聚焦及拍照记录。关机操作。四、透射电子显微镜样品制备1、试剂配制02mol／LPBS:A液:磷酸氢二钠(Na2

HPO4

·2H2

O)35、61g加双蒸水溶解至1000ml。B液:磷酸二氢钠(NaH2

PO,·2H2

O)31、21g加双蒸水1000ml。依据不同要求,按不同配比,可得不同pH值的0、2mol／L的PBS,见下表:表2-1不同配比的PBS的pH值pH(25℃)A液(ml)B液(ml)

、0

7、2

、4、5

、643、56、525％戊二醛(C550ml,加双蒸水40ml。

HO)固定液:25％戊二醛10ml,02mol/LPBS8 21％四氧化锇(OOS 4

)固定液。2％贮存液:取1gOOS 4

安瓿泡酸48h,冲洗48h,双蒸水漂洗30min。1～2道痕,置入棕色磨口瓶,加双蒸水50ml,用力摇动使安瓿裂开。静置48hOO溶解后备用。4℃避光保存。S 41％使用液:取2％OsO4

贮存液10ml,加0、2mol/LPBSl0ml混合。不同浓度的乙醇溶液:用无水乙醇稀释成90％、80％、70％、60％、50％的乙醇。90％丙酮用无水丙酮稀释。Epon812(Luft):A:Epon812612ml,DDSA10ml。B液:EpOn81210ml,MNA8、9ml。使用时依据不同硬度要求按确定比例(1:1～1:9)混合,A液多,则软。AB液混匀后,逐滴参与DMP-30,其浓度把握在1％～2％。边加边搅,充分搅拌30min左右。醋酸铀染液:醋酸双氧铀UO2

(CHO)2 3 22

·2H2

O(Uraniumacetate)溶于50％～70％乙醇溶液中至饱与,静置1～2天,使未溶的局部沉淀,取上部黄色透亮溶液用,避光保存。枸橼酸铅溶液:A液硝酸铅[Pb(NO)32

必需为近产品)1、33g,枸橼酸钠(NaCHO3 6 5 7

·2H2

1、76g,双蒸水(用前加沸冷却)30ml,充分摇匀,混悬液为乳白色枸橼酸铅铬合物。B液:氢氧化钠(NaOH)lmol／L。使用液:A液配制完毕30min后,加B液8ml,加双蒸水至50ml混匀,溶液清亮(pH12)。如有沉淀,离心后再用。最多保存半年。2、超薄切片制备取材,,以免细胞内部微小构造发生转变:①取材部位要准确;②无人工损伤,不要,⑧样品块要小,一般切成lmm3的小块,起码在某一个方向上的厚度要小于lmm,(1min之内)进入预冷的戊二醛固定液中(4℃)保存。固定固定就是电镜样品制备中最重要的一环,其目的就是使细胞生命过程马上终止,使细胞构造与化学成分保持生前状态。电镜材料固定一般承受双重固定法,即先用戊二醛进展前固定,然后再用锇酸进展后固定。两次固定之间要进展漂洗。前固定:25％戊二醛溶液中,4℃条件下固定3h,可保存在02mol/L的PBS中或2、5％戊二醛溶液固定液中(4℃)。说明:戊二醛(CHO)分子量为10012,就是一种五碳双醛,市售浓5 8 2、0。氧气、高温、中性或碱性均可使其失去醛基,应低温、密封保存。两个醛基与蛋白质、核酸等的氨基发生交链作用,可以较好地固定蛋白质、核酸与多糖等,能保存微管、糖原、核蛋白与细胞基质等,不易使酶失活,可以用于细胞化学争论,但不能固定脂类,对脂质颗粒、膜构造等保存不好。假设对保存超微构造(尤其膜系统)有较高的观看要求,经戊二醛溶液单固定的二醛固定液对组织的平均渗透深度为06mm,这就是取材要小的缘由之一。锇酸后固定:进展后固定以前,材料要用002mol／LPBS漂洗3次,l0min。避开戊二醛与OOS 4

发生氧化复原反响,生成沉淀,所以,转入1％OS

O固定液中,4℃条件下固定1～42h。说明:四氧化锇(OOS 4

)分子量254、2,呈淡黄色结晶,其水溶液呈中性。对氮有较强的亲与力,能与蛋白质氨基快速结合形成交链化合物,,生成四氧化锇二酯化合物,使含有脂类的构造固定。由于锇就是一种高原子序数元素,在用OO固定样品的同时,还起到一种电子染色作用。但S 4就是,OOS 4

不能固定核酸,,OOS 4

又就是酶的钝化剂,不能用于细胞化学争论。OOS 4

固定时间太长,不仅易丧失成分,而且会使组织变脆,OS

O具有极强的挥发性与毒性,在任4何污染与光照条件下,都可能复原成水与二氧化物而减弱固定效果,故不易长期保存,呈棕色或黑色时,1％OS

O固定液对组织的渗4透深度比戊二醛还差,有试验证明仅在0、25～0、5mm深度内有快速均匀的固定,稍大的组织易形成固定梯度。脱水将OOS 4

固定后的材料取出,在脱水以前要进展漂洗。先用吸水纸吸干净OOS 4

固定液之后,用0、2mol／L的PBS漂洗3次,每次10min。以避开在脱水时OO与乙醇产生氧化复原反响,生成沉淀,所以要彻底S 4洗干净。50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、809090％乙醇与90％丙酮的1:1100％丙酮,每级15～20min,使组织中的水分充分除去。说明:脱水剂一般用乙醇、丙酮与环氧丙烷等,利用它们具有能与水也能与包埋剂混溶的特点,以取代样品中的水分,使水分充分除去。浓度梯度脱水就是为了削减样品收缩。浸透,即用包埋剂与脱水剂按浓度梯度分级换液,使包埋剂渐渐取代脱水剂渗透到组织中去,最:在室温下或373:1的100,10～30min;1:1的100,30～60min;1:3的100％丙酮溶液与包埋剂混合液,1～2h或过夜;纯包埋剂,2～5h或过夜。包埋包埋的目的就是让样品材料获得确定的硬度、弹性与韧性,以便制成超薄切片。操作过程如下:在包埋模具内滴一滴包埋剂,把样品置入并使之定位于适宜位置(依模具而异),缓缓注入包埋剂,然后放入烤箱中进展聚合(使包埋剂固化)。控温准时间依次为:37℃,12h;45℃,12h;60℃,24h。说