基因工程第二章载体

基因工程第二章载体第1页，课件共22页，创作于2023年2月第二章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasmidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第2页，课件共22页，创作于2023年2月质粒载体的生物学特征（1）质粒是一种广泛存在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。质粒的拷贝数多则50，少则只有一个。第3页，课件共22页，创作于2023年2月（3）质粒的不亲和性，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存，属于同一个不亲和群，如pMB1或ColE1的派生质粒。已鉴别出25个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们是不相容群体的。（4）质粒的分类F质粒，或叫致育质粒，仅携带转移基因，特征：促进质粒间的有性结合。R质粒，或叫耐药性质粒，能赋予宿主细胞耐药性，特征：耐药性。Ti质粒,根瘤农杆菌中的毒性质粒，赋予宿主细胞致病性。

Col质粒，降解质粒，质粒载体的生物学特征第4页，课件共22页，创作于2023年2月（5）质粒的存在形式

有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移率。其中走在最前面的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。双螺旋共价闭合环（超螺旋SC构型）开环双螺旋（一个裂口，OC构型）线状双螺旋（两个裂口，L构型）质粒载体的生物学特征第5页，课件共22页，创作于2023年2月（1）pUC是在pBR322基础上发展起来的克隆载体。大小为2.7kb，带有复制起始位点，ampicillin抗性基因和lacZ

基因。常用质粒载体介绍第6页，课件共22页，创作于2023年2月（2）pGEM-3Z

带有

LacZ

基因，大小为2.9kb，氨苄青霉素抗性基因，高拷贝。第7页，课件共22页，创作于2023年2月（3）pBluescriptSK

pBluescriptSK同pGEM类似，另外还带有线状噬菌体f1的复制起始位点。

可以产生单链DNA。第8页，课件共22页，创作于2023年2月第二章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第9页，课件共22页，创作于2023年2月第二节噬菌体载体一、噬菌体

1噬菌体的生物学特征

2噬菌体的侵染3噬菌体的DNA分子二、M13噬菌体第10页，课件共22页，创作于2023年2月

噬菌体的生物学特性

噬菌体由正二十面体的蛋白质头部和中空管状的蛋白质尾部组成。头部包含线状染色体DNA，侵染寄主时将自己的DNA注入寄主细菌。噬菌体属温和噬菌体。第11页，课件共22页，创作于2023年2月噬菌体的生物学特性

ThePhage

consistofalinearchromosomeenclosedinaproteincoat(capsid,衣壳).Whenthephageinfectingthehostcells,itinjectsitsDNAintothehostbacterium.第12页，课件共22页，创作于2023年2月

噬菌体的侵染噬菌体的侵染是溶源侵染，是噬菌体DNA分子在宿主细胞中能够稳定存在，许多噬菌体DNA能整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体（prophage

）。而携带了原噬菌体的细菌被称为溶源菌（lysogen）

。第13页，课件共22页，创作于2023年2月

噬菌体的侵染第14页，课件共22页，创作于2023年2月噬菌体的侵染过程Lysogeniccycle

(溶源周期)：Undercertaincircumstances,however,thelambdaDNAinsertsitselfintotheE.colichromosomeandisastablepartofthechromosome.TheLambdaDNAisreplicatedalongWith

theE.colichromosome.Ifthehostcellbecomesdamaged,suchasUVtreatment,theprophageDNAexcisesitselfandundergoeslyticgrowth.第15页，课件共22页，创作于2023年2月噬菌体的DNA分子DNA的分子为49kb,大多数基因已经测序和定位。至少包括61个基因，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分（b2区）可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能。第16页，课件共22页，创作于2023年2月噬菌体的DNA分子

DNA在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesiveendsite）.另外的作用是内切核酸酶的识别序列。

第17页，课件共22页，创作于2023年2月第二节噬菌体载体一、噬菌体二、M13噬菌体

1M13噬菌体的生物学特征

2M13噬菌体的侵染3M13噬菌体的载体第18页，课件共22页，创作于2023年2月1.M13噬菌体的生物学特性

M13是线状的大肠杆菌噬菌体，颗粒内含有6047bp的闭合环状单链DNA基因组，相对小，意味着可供插入的外源DNA的空间小。M13单链DNA的复制型（RF，replicativeform）是呈双链环形，此时的DNA，不会插入细菌基因组，持续复制，当积累到100-200个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到外壳蛋白中形成了大量新的噬菌体颗粒。第19页，课件共22页，创作于2023年2月M13噬菌体的侵染第20页，课件共22页，创作于2023年2月作为载体的优势1基因组小于10kb,适合载体的要求。2复制时其双链形式，可以像对质粒一样处理。3容易培养或转染，容易获得基因组。4突出优点在于可以提供单链DNA，这在DNA测序和体外突变中作用明显。4在M13基因组中有一段507bp的基因间隔区，该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于载