微生物遗传学第四章细菌转移课件

2023/7/30第四章细菌基因转移和基因重组2023/7/30第二节接合(conjugation)供体菌（F+）通过性菌毛与受体菌（F-）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，并使其获得若干新遗传性状的现象。大肠杆菌的接合能进行接合的微生物种类主要在细菌和放线菌中进行。细菌中，尤其G-菌较为普遍。接合还可发生在不同属的一些菌种间。

接合的意义抗生素抗性外毒素抗性新的代谢能力2023/7/302023/7/30通过接合而获得新遗传性状的受体细胞叫接合子。介导接合作用的质粒叫接合质粒(自主转移质粒、性质粒)。2023/7/30接合的特征特征1：需要供体细胞和受体细胞的直接接触，在G-是通过质粒编码的性菌毛介导的，在G＋细菌中没有性菌毛，由受体细胞分泌类似于性激素的短肽刺激细胞接合。2023/7/30特征2：需要质粒参与。G-细菌中质粒分子量较大，有几十个tra基因参与DNA转移，而G＋细菌中质粒小，只有几个tra基因参与DNA转移。2023/7/30特征3：无论G-或G＋，质粒能只从供体细胞向受体细胞转移.是自然界微生物遗传物质交换的重要途径。大肠杆菌，自主转移质粒是F因子。2023/7/301.接合现象的发现与证实1946年，J.Lederberg&Tatum的大肠杆菌杂交试验：材料：大肠杆菌(E.coli)K12菌株的两个营养缺陷型品系：菌株A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-；菌株B—苏氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。方法：将A、B两菌株混和，在基本培养基(固体)上涂布培养。结果：平板上长出原养型菌落(++++)。2023/7/30+-？结果原养型菌株以10-5－10-6的频率出现2023/7/30

质疑：⑴细菌的杂交实验获得的重组子可能是转化的结果。⑵培养基中含有某些代谢产物，混合后这些产物互相补充了对方的不足而得以在基本培养基上生长。(3)回复突变2023/7/30转化的排除（1）当时Lederberg和Tatum已证明，把菌株A的培养液经过灭菌，再加入到B菌株的培养液中，没有原养型菌落，说明并非转化的结果。2023/7/30证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）转化的排除(2)2023/7/30互养的排除营养缺陷型菌株通过培养基交换养料而生长的现象称为互养。如将基因型A-B+T1s和A+B-T1r两菌株在基本培养基上混合培养，接触较短的一段时间以后，喷上噬菌体T1,把A-B+T1s杀死，经培养后仍有原养型菌落出现。A-B+T1sA+B-T1rT12023/7/30回复突变的排除大肠杆菌的突变率一般都是<10-8，若两个基因同时回复突变，则可能性只有<10-16，这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出现10-5-10-6频率的菌落一定是重组的结果。MCB1402/16/051514.11J.Lederberg,E.Tatum(1946)

Novelgenotypesinmixedculturesofbiochemicalmutantsofbacteria.ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.11:113-114.MCB1402/16/0516草履虫2023/7/30W.Hayes的实验（1952）该实验说明细菌接合过程中遗传物质的转移是单向的，即遗传物质从A株转移到了B株。A:met-bio-thr+thi+B:met+bio+thr-thi-2023/7/30大肠杆菌的两种类型Hayes(1952)研究表明：大肠杆菌两种不同菌株(品系)接合过程中遗传物质的转移是单向的；从而认为大肠杆菌存在两种类型：雌性与雄性，分别作为接合过程中遗传物质的受体与供体。供体菌称为雄性菌，受体菌称为雌性菌。有学者认为，具有性菌毛的细胞可以叫做雄性，这种细丝状的菌毛像一种分子阴茎，与缺乏性菌毛的雌性细胞交合（德迪夫1999）。威廉斯（2001）的观点：“在细菌和病毒以及在所有高等生命体的主要类型中，遗传重组现象的存在表明，性别的分子基础是来自远古的进化演变的产物”。2023/7/302023/7/302.F质粒的发现证明了细菌的接合是遗传物质的单向转移后，Hayes偶然发现了作为原始供体的A菌在冰箱里存放了一年后出现一种变种，变种和正常的B菌杂交时缺乏将遗传物质传给B菌株的能力。他把这个不育变种的一个Strr

突变型分离出来，并把它和可育的StrsA菌株一起繁殖，将其涂布在含有链霉素的平板上，分离后再和B菌株杂交，结果使不育的菌株回复了可育性（大约1/3恢复）。2023/7/30大肠杆菌的可育性解释A菌株之所以能成为供体，是因为它含有一个性因子（sexfactor），又称致育因子（fertilityfactor），简称F因子。2023/7/30F因子的特点大肠杆菌的供体或雄性细胞记为F＋，带有一个性因子或致育因子F，而另一个不带性因子F的受体细胞或雌性细胞记为F-杂交F+ХF－是可育的，杂交F-ХF-是不育的F因子可以转移，从F+到F-，但必须通过细胞接触F因子能自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从一个F+再把它传递过来。2023/7/30

F+是一种遗传性状，F因子的存在使细菌称为F+，F因子的丧失使细菌成为F-，F+分裂仍得到F+细胞。其特性类似于染色体，但染色体基因转移的频率不超过10-6，F因子转移的频率高达70％以上。因此，F因子就是质粒Lederberg,J.,Cavalli,L.L.,andLederberg,E.M.,Nov.1952,"SexcompatibilityinEscherichiacoli",Genetics37(6):720-7302023/7/303.F质粒的结构已经对F质粒的基因组进行了全序列测定。F质粒为双链环状DNA分子，DNA长度为99159bp（约100kb），约是大肠杆菌基因组的2％，其中1/3的基因与接合作用有关。整个基因组由3个主要区段组成：转移区、复制区、插入区。2023/7/302023/7/30转移区转移区的长度为33kb，由23个基因组成，构成一个tra操纵子。与性菌毛的形成有关。控制基因转移该区最后进入受体细胞2023/7/30复制区复制区负责F质粒的自我复制，F质粒的自主复制区为oriV，在oriV中包含复制起点。F质粒的复制是按θ型方式进行双向复制，是一种严紧型质粒，1-2拷贝/细胞。Inc基因产物使细胞具有不相容性。2023/7/30插入区包含4个插入顺序：2个IS3，一个IS2，1个Tn1000，它们与F质粒的整合、切除和易位有关。2023/7/30F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上2023/7/30高频重组(Highfrequencerecombination,Hfr)1951年Cavalli发现用氮芥处理F＋然后将处理后的F＋×F－

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1954年Hayes也分离了Hfr品系，发现：

(1)Hfr使重组能力增加，但无传递F因子的能力，Hfr×F－

F－

(2)Hfr只能将供体基因组的一部分传给受体，Hayes的解释是Hfr的F因子发生了永久性改变。F＋×F－——

Hfr2023/7/304.F质粒在细胞内的存在状态根据细胞中是否存在Ｆ因子以及其存在方式的不同，可把E.coli分以下四种相互有联系的接合型的菌株。a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收

F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。2023/7/302023/7/30细菌接合的电镜照片2023/7/305.F质粒与接合作用(1)

F+×F-杂交带有F质粒的细胞在形态学上与F－明显区别。除共有大量的表面菌毛外，F＋还有少量性菌毛。接合作用分两步:接合配对和DNA转移F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。2023/7/302023/7/30F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用，产生胞质桥；

F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。

F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的F因子。复制完成后，F-细菌变成F+，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。2023/7/30(2)Hfr×F-杂交Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此为高频重组菌株。质粒通过不同的机理整合到染色体上，包括质粒和染色体序列的同源重组。正常的重组需要两个DNA之间有同源性，但大多数质粒的序列具有不同于染色体的独特性。但质粒和染色体有共同插入序列和转座因子。这些转座因子间的同源重组可导致质粒的整合。2023/7/30插入如何产生Hfr?大肠杆菌染色体有7个IS1、13个IS2和6个IS3，F质粒有1个IS2和2个IS3，因此大肠杆菌染色体上有19个IS介导的Hfr形成位点。F质粒插入染色体上位置随机，方向随机，结果产生不同的Hfr菌株。2023/7/30Hfr菌株的形成及其基因重组2023/7/30Hfr与F-菌株接合过程Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。2023/7/30Hfr与F-菌株接合结果Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高。2023/7/302023/7/30（3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：供体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。2023/7/302023/7/302023/7/30部分二倍体：

当Hfr菌的部分染色体进入F－细胞后，F－细胞中就成为部分二倍体（partialdiploid）或部分合子（merozygote）。2023/7/306.中断杂交（interruptedmating）技术Hfr细菌和F-接合后，染色体按一定速度和方向进入F-，由于DNA转移从oriT起始，F质粒的主要部分应该在最后进入受体，但杂交后，F-并不转变为F＋说明大部分F因子并没有进入受体。利用Hfr×F-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。2023/7/30中断杂交实验作图

(interruptedmatingexperiment)中断杂交实验1957年E.Wollman和E.Jacob设计完成供体：Hfrstrsthr＋leu＋azirtonr

lac＋gal＋受体：F－ strr

thr－

leu－azistons

lac－gal－中断杂交F－Hfr杂交一定时间间隔基本培养基含链霉素thr+leu+strr重组子2023/7/30将大约10倍的F-菌和Hfr对数期的菌混合，轻轻振荡培养，在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌器中剧烈振荡。振荡后的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基上，筛选thr+leu+strr重组子。再对每一个重组子的非选择性标记azitonlacgal进行测定。2023/7/302023/7/30从图可知，混合5分钟后取样时，所得菌落的非选择标记全部和F-菌株相同，表明还没有任何Hfr菌的基因进入受体菌。混合10分钟取样，重组体中有10％含Hfr的azi基因，但几乎没有ton和gal基因，25分钟时，gal基因才出现。在60分钟后，thr+leu+strr重组体的数目达到最高点，非选择性供体标记趋于平衡。在这些重组体之间，非选择性供体标记从azi基因的90％到gal基因的25％。因此Hfr和F杂交建立起稳定的接合对时，供体的染色体的转移是从一个固定点开始的，以0－t