线虫培养和繁殖

线虫生长培养基（NematodeGrowthMedium，NGM）的配制1）称取蛋白胨（peptone）2.5g，琼脂20g，NaCl3g，置于洁净2000mL玻璃三角瓶，加入蒸馏水975ml，120℃高压蒸汽灭菌30min，之后置于552）依次加入5mg/ml胆固醇（乙醇溶解，不灭菌）1ml，高压灭菌的1MMgSO4，1MCaCl2，1MKPO4缓冲液（pH6.0）各1ml，摇匀即可。1MKPO4缓冲液的配置方法为：称取108.3gKH2PO4和35.6gK2HPO4，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值到6.0即可。1.3倒板1）倒平板在无菌条件下进行，应保证倒入每个无菌培养皿（直径6cm）的培养基量基本一致，否则平板的厚薄相差太大将会影响观察。也可以用移液器分装8-9ml到每一个培养皿中，保证每个平板厚度基本一致。2）将倒好的平板在室温下放置1~2天，一方面可以检验是否有污染，一方面让水汽晾干，之后可倒置于4℃1.3菌液测试菌液测试：因为OP50菌株是无抗性的，所以在大批量铺菌前需进行菌液测试的。1）将扩增好的OP50菌液摇匀，用移液器吸取约20uL至NGM平板中，用三角玻棒推开，每瓶菌液测试4-6个平板。2）将铺好的平板倒置，于37℃3）如果确认无污染后，在超净台中将菌液分装到无菌离心管中，约15mL/管，4℃4）若测试板上长出大量杂菌（菌落突起，色泽亮丽），需重新摇菌。1.4铺菌可以用两种方法给NGM平布铺菌：涂板法和滴板法。涂板法:将菌液倒入无菌一次性培养皿（直径6cm）中，用三角玻棒蘸取菌液，铺在平板上，蘸一次铺一个。铺10个培养皿，三角玻棒须蘸上酒精灼烧一次，防止污染培养皿里的母液。注意三角玻棒不样碰到培养皿的内壁，整个过程无菌操作。滴板法：准备高压灭菌后的无菌玻璃吸管，在酒精灯上来回移动灼烧后稍晾凉，从分装的菌液中直接吸取菌液，悬空滴在NGM平板的中央，可滴1-3滴，这种方法可以避免使用三角玻棒接触培养基，污染的概率比较小，缺点是这样得到的菌苔边缘非常厚。2线虫的繁殖2.1在NGM平板间转移线虫的方法线虫周身透明，可以通过有透视光源的解剖镜进行观察。通常用到的目镜是10倍，物镜1-5倍多档。也就是说总共放大10-50倍。三种方法可用于NGM平板间的线虫转移，第一种非常快速且方便，简称为“chunking”，也即切块法。当平板上的OP50被吃光后，用无菌解剖刀切下一小块琼脂（指甲盖大小即可）放入新NGM平板上。通常每个小块上有几百条线虫。解剖刀需要提前消毒，通常蘸取75%乙醇，在酒精灯上过火，灼烧片刻即可。这种办法广泛用于饥饿平板上的线虫转移，尤其当线虫钻入琼脂内，无法挑取时。切块法主要用于纯合品系线虫的转移，如果是杂合子或者需要通过杂交保存的品系最好不要使用此方法。第二种方法用灭菌滤纸条转移法，将灭菌滤纸条（通常宽度1厘米，长度5厘米）放到饥饿的平板上，当滤纸吸收了水分并粘附了许多线虫后，轻轻的用滤纸条接触新的平板，实现线虫的转移。同样的第三种方法是用挑虫器（wormpicker）挑取单只或多只线虫转移到新的平板中。Picker是由铂金丝和玻璃管组成，铂金丝的一端通过灼烧连接到玻璃管上，另一端压平呈铲状。在解剖镜下找到目标线虫后，用picker末端在线虫的附近压琼脂培养基，使线虫爬到picker上再转移到新的平板中；或者用picker末端蘸取少量OP50，轻轻地而且快速的碰触线虫的上部，线虫被picker上的菌液粘住。往新的平板放线虫时，注意要慢慢降低picker末端，轻轻接触琼脂平面或菌苔边缘等线虫爬出来，不要将琼脂戳破，否则线虫喜欢钻入琼脂中，这样在做雌雄杂交需要统计后代表型时，被统计的群体数会大大减少。Picker上的铂金丝升降温非常快，对任何培养皿进行操作的前后都应该将pick的铂金丝过火灭菌。转移线虫时，注意开关盖子要操作迅速，而且盖子要趴着放在旁边。每个线虫培养皿都需要标记品系名（甚至是详细的基因型）以及日期，字迹清晰以免混淆各个品系。记住要标记在有琼脂培养基的培养皿上，不要标记在盖子上。废弃的平板统一放入有盖的垃圾桶里。2.2线虫转移频率的确定转移线虫的频率由培养线虫的基因型，温度以及实验目的决定。杂合子或者杂交群体最好每两代转移一次，而且在OP50被食用光前转移操作起来比较简单。如果需要从饥饿平板中转移单只线虫时，可以先通过切块法让线虫爬出来，再挑取目标线虫。如果需要得到有各个发育阶段的线虫群体，可以每一天都转移一次线虫，连续4天基本即可得到包含全部发育阶段的线虫群体。25℃的培养的线虫将食物吃光需要的时间比15℃培养的要长一倍，所以温度决定了你的转移频率。另外为了防止平板蒸干，可以用parafilm将平板密封保存2.3线虫的培养温度线虫在16℃-25℃之间生长良好，不过更通用的培养温度是20℃。已有的研究表明25℃下线虫的生长速度比16℃快2.1倍。20℃下线虫的生长速度比16℃快1.3倍。培养线虫时要根据线虫品系的要求在合适的温度培养。因为有的线虫品系只能在16℃3.处理污染的线虫线虫在培养过程中，有可能被霉菌，酵母，粘菌污染，虽然这些污染对线虫没有什么伤害，但是对干净的线虫进行性状统计和转移远比对污染的线虫进行相同的操作要容易得多，所以要及时处理污染线虫。3.1霉菌的清理如果NGM平板中的霉菌很小，而且只有少量菌丝，没有孢子时，可以用消毒解剖刀切掉霉菌，以阻止其继续繁殖。但是很多时候，当你发现霉菌时，霉菌菌丝扩散范围比较大，而且孢子也形成了，并飞散到平板各个位置。这时可以通过切块-转移法清理线虫上携带的霉菌孢子。具体操作步骤如下：1）将解剖刀置于火焰上消毒，切取霉菌污染平板的琼脂一小块，记住打开和关上已污染平板的盖子要迅速。2）将小块转移到新平板的琼脂上，记住不要放在菌苔上。等待线虫从小块上爬进菌苔中，在爬行中，线虫体表的霉菌孢子被OP50粘走了。3）一旦线虫到达小块对面的菌苔边缘，用picker挑取线虫到新的平板中即可。3.1粘菌和酵母的清理粘菌和酵母的清理主要通过裂解法完成，次氯酸钠裂解液能裂解线虫虫体，但不损伤有卵壳保护的卵。裂解液由5M氢氧化钠溶液和0.5%次氯酸钠溶液按1：2的体积比混合即可，最好现配现用。4.线虫的冻存与复苏4.1线虫的冻存线虫可以在液氮中永久保存，这为线虫广泛应用于科学研究提供了方便。线虫冻存成功与否取决于三个因素；用于冻存的线虫处于合适的发育阶段；冻存液中甘油的比例合适；在-80℃与非饥饿状态的线虫（成虫，dauer）以及卵相比，刚刚处于饥饿状态的小幼虫（L1-L2时期）在冻存后仍有较好的存活率。因此一般选刚刚处于饥饿状态（OP50菌苔已被吃光）、且有比较多L1-L2线虫的平板用于冻存。当冻存液中甘油的终浓度为15%时，即可保证比较好的存活率。在冻存过程中必须保证以每分钟下降一度的速度降温直至-80℃。首先将含有冻存线虫的冻存管置于泡沫聚乙烯盒子（盒子中有插入冻存管的空腔），然后将盒子置于-80℃冰箱中，12冻存中需要两中溶液S缓冲液以及含有30%甘油（体积比）的S缓冲液。S缓冲液配方：0.05MK2HPO4129ml，0.05MKH2PO4871ml，NaCl5