头孢氨苄血药浓度测定方法研究课件

头孢氨苄血药浓度测定方法研究

STUDYONTHEPLASMALEVELDETERMINATIONOFCEFALEXIN

学生：徐勇军导师：杜智敏教授专业：临床药学

哈尔滨医科大学药物研究所2005年6月

头孢氨苄血药浓度测定方法研究

STUDYONTHE1

前言

头孢氨苄（Cefalexin）属半合成第一代口服头孢菌素，口服吸收迅速完全、毒性低、抗菌谱广，临床上主要用于尿道感染、呼吸道感染及皮肤软组织感染，为目前我国常用抗生素类药物。为确保用药的安全性和有效性，常需要测定体液中药物的浓度，以考察药物在体内的吸收程度。由于生物样品取样量少、药物浓度低且存在内源性物质的干扰及个体差异等多种因素影响，所以，一种灵敏、快速、简便的体内药物分析方法的建立显得尤为重要。前言头孢2

实验目的建立反相高效液相色谱测定人血浆中头

孢氨苄浓度的方法实验目的3实验研究

仪器

Waters高效液相色谱系统（510泵，717自动进样器，996二极管阵列检测器，2010色谱管理系统）XW-80型漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）高速台式离心机（美国ABBOTT公司）KQ-2300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

实验研究仪器Waters高效液4实验研究药品供试药品：头孢氨苄片

（A制剂，广州白云山制药总厂提供，规格0.25g/片，批号0471201）参比制剂：头孢氨苄片（B制剂，哈药集团制药总厂提供，规格0.25g/片，批号A04110678）标准品：头孢氨苄（含量94.2%，中国药品生物制品检定所提供）内标物：头孢哌酮（含量94.4%，中国药品生物制品检定所提供）

实验研究药品供试药品：头孢氨苄片5实验研究试剂

甲醇（Merck公司）——色谱纯冰醋酸（沈阳环化特种试剂有限公司）——分析纯醋酸铵（天津市凯通化学试剂有限公司）——分析纯三氯乙酸（北京市兴津化工厂）——分析纯水——Millipore滤过后的超纯水实验研究试剂甲醇（Merck公6实验研究测定条件

色谱柱：YWGC18柱（250mm×4.6mm,10µm），

EasyguardC18保护预柱流动相:水-甲醇-2.5mol·L-1醋酸铵-冰醋酸

（90：30：0.45：0.016v/v）流速：1.0mL·min-1柱温：室温25℃检测波长：254nm进样量：50µl实验研究测定条件色谱柱：YWGC18柱（7实验研究溶液配制

储备液

内标液沉淀剂三氯乙酸10.0%（w/v）三氯乙酸沉淀剂经0.45µm微孔滤膜滤过置50ml容量瓶中去离子水溶解并定容混匀5.0g精密称取100µg·mL-1头孢哌酮内标液置50ml容量瓶中流动相溶解并定容混匀5.0mg精密称取头孢哌酮置25ml容量瓶中流动相溶解并定容混匀500µg∙mL-1头孢氨苄标准储备液12.5mg精密称取头孢氨苄标准品实验研究溶液配制储备液三氯乙酸10.0%8实验研究溶液配制血浆标准溶液100µg∙mL-150µg∙mL-125µg∙mL-110µg∙mL-10.5µg∙mL-1精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血浆定容1µg∙mL-15µg∙mL-1精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血浆定容精密量取1ml置于10ml容量瓶中用空白血浆定容

500µg∙mL-1

头孢氨苄储备液精密量取2ml置于10ml容量瓶中用空白血浆定容精密量取1ml置于10ml容量瓶中用空白血浆定容精密量取0.5ml置于10ml容量瓶中用空白血浆定容精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血浆定容实验研究溶液配制血浆标准溶液100µg∙m9实验研究样品处理

全血样品肝素抗凝离心（25℃，4000r∙min-1，5min）分离出血浆于-20℃低温冷藏血浆样品准确加入500µL具塞塑料离心管中准确加入100µL内标液（100µg∙mL-1头孢哌酮）混匀准确加入200µL沉淀剂（10.0%w/v三氯乙酸）旋涡震荡混匀离心（25℃，10000r∙min-1，5min）上清液进样实验研究样品处理全血样品离心分离出血浆血10实验研究

标准曲线的制备

将上述配制的100、50、25、10、5、1、0.5µg·mL-1系列浓度的标准溶液，按“血浆样品的处理”项下操作进样，记录峰面积值，以头孢氨苄峰面积与内标头孢哌酮峰面积的比值（Y）对浓度（C）作加权线形回归，绘制血浆标准曲线。实验研究标准曲线的制备将上述配制的100、50、211实验研究方法精密度试验

按“血浆标准溶液的制备”项下操作，精密配制高、中、低（100、25、1µg·mL-1）三种浓度含药血浆（n=5），按“血浆样品的处理”项下操作进样，由标准曲线回归方程求出各血样的药物浓度，每种浓度1d内平行测定5次和连续3d每天各浓度平行测定5次，分别测定日内变异和日间变异，考察方法精密度。实验研究方法精密度试验按“血浆标准溶液的制备”项下12实验研究方法准确度试验按“血浆标准溶液的制备”项下操作，精密配制高、中、低（100、25、1µg·mL-1）三种浓度的含药血浆（n=5），按“血浆样品的处理”项下操作进样，由标准曲线回归方程求出各血样的药物浓度，将求得的浓度与已知的参考浓度相比，计算血样中头孢氨苄的相对回收率，考察方法准确度。实验研究方法准确度试验按“血浆标准溶液的制备”项下13实验研究提取回收率试验

按“血浆标准溶液的制备”项下操作，精密配制高、中、低（100、25、1µg·mL-1）三种浓度的含药血浆（n=5），按“血浆样品的处理”项下操作进样，测得药物峰面积和内标峰面积，求其比值R1=A药/A内。另取同浓度的标准品直接进样所测峰面积和内标峰面积，求其比值R2=A´药/A´内。每种浓度平行测定5次，两比值之比（R1/R2）即血样中头孢氨苄的绝对回收率。实验研究提取回收率试验按“血浆标准溶液的制备”14实验研究样品稳定性试验

精密配制高、中、低（100、25、1µg·mL-1）三种浓度的血浆样品（n=5），分别在不同条件下处理：置-20℃及室温反复冻融3次；置-20℃低温放置7、14d后测定；血浆提取液室温放置12h等进行稳定性试验，以确定血浆样品的保存及样本的室温放置时间。实验研究样品稳定性试验精密配制高、中、低（1015实验研究结果空白血浆标准品+内标物专属性考察（1）实验研究结果空白血浆16实验研究

结果空白血浆+标准品+内标物受试者服药4h后血浆专属性考察（2）实验研究结果空白血浆+标准品+内标17实验研究

结果

头孢氨苄峰的保留时间为8.482min，内标峰的保留时间为10.365min，药物与内标吸收峰分离良好。血浆中的内源性组分不影响头孢氨苄的分离测定。专属性考察（3）实验研究结果18实验研究

结果

血浆中头孢氨苄在0.5~100µg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。血浆中头孢氨苄最低检测浓度为0.5µg·mL-1（S/N>3）Y=0.1215C+0.0321(n=7)γ=0.9995

头孢氨苄血浆标准曲线Weight=1线性关系与灵敏度实验研究结果Y=19实验研究

结果

表1头孢氨苄血浆日内变异测定数据及结果（n=5）

日内变异（RSD＜15%）方法精密度（1）实验研究结果20实验研究

结果方法精密度（2）表2头孢氨苄血浆日间变异测定数据及结果（n=5）

日间变异（RSD＜15%）实验研究结果方法精密度（2）表221实验研究

结果表3头孢氨苄血浆相对回收率测定数据及结果（n=5）血浆中头孢氨苄的相对回收率为85.5%~114.1%（RSD＜15%）

方法准确度实验研究结果表3头孢氨苄血浆相对回收22实验研究

结果表4头孢氨苄血浆绝对回收率测定数据及结果（n=5）血浆中头孢氨苄的绝对回收率为51.1%~84.4%（RSD＜15%）

提取回收率实验研究结果表4头孢氨苄血浆绝对回23实验研究

结果

精密配制高、中、低（100、25、1µg·mL-1）三种浓度的血浆样品（n=5）：①置-20℃及室温反复冻融3次

②冰冻放置7、14d

③血浆样品提取后室温放置12h等对其稳定性进行考察（与日内、日间变异同时进行测定）。测得头孢氨苄的血浆含量无明显变化（RSD＜15%），头孢氨苄稳定性较好。样品稳定性实验研究结果精密配24

讨论对体内药物浓度测定而言，反相HPLC优点明显：可供选择的键合相范围增大，具有高效率和高选择性；反相柱的性能不会因痕量的水分而发生改变，组分的保留时间比较恒定。因此，本实验采用了反相高效液相色谱法进行头孢氨苄血浆含量的测定。实验表明本法简便，快速，分离度好，适合对头孢氨苄进行血药浓度测定。测定方法的选择讨论对25讨论文献报道，头孢氨苄的最大吸收波长为262nm。而以本实验流动相为本底，所扫描到的λmax为254nm。为了增加检出灵敏度，本方法选择在254nm处进行测定，色谱图显示基线平稳，其他杂质干扰较少，此波长适合对头孢氨苄血浆含量进行测定。检测波长的选择讨论文献报道，头孢氨苄的26讨论

本实验曾对水-甲醇（90：30）、水-甲醇-4%醋酸-3.86%醋酸钠（145：50：0.6：3）、水-甲醇-2.5mol·l-1醋酸铵-冰醋酸（90：30：0.45：0.016）等进行选择，发现有些作为流动相根本无法分离样品或分离度不好。

经反复试验,选择了水-甲醇-2.5mol·l-1醋酸铵-冰醋酸（90：30：0.45：0.016）作为流动相，分离度较好，而且组分保留时间适当，不受干扰，能使样品中各组分较好地分离。讨论本实验曾对水-甲醇（27

讨论

以内标法定量可提高检测结果的可靠性。参考有关文献，本实验曾对头孢唑啉、头孢曲松、头孢噻吩、头孢拉定，头孢哌酮等进行试验选择。结果发现，有些作为内标时分离度不好，或对样品分离有干扰。

经反复摸索最后确定了头孢哌酮作为内标，内标峰的保留时间为10.365min，药物峰的保留时间为8.482min，分离度好，且不产生干扰。内标物的选择讨论以内标法定量28讨论在实验过程中,色谱柱性能的稳定是十分重要的。由于本实验所用流