糖化酶固定化实验报告

学号:姓名:专业:其他组员:学号:姓名:专业:其他组员:指导老师:实验时间:糖化酶固定化实验报告080500130黄兆峰微生物工程黄志成、李盟、苏温培朱秋享2008.11.5—2008.11.7一、 目的要求本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。二、 基本原理游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。酶活测定原理：糖化酶（即淀粉a-1,4-葡萄糖昔酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1,4-葡萄糖昔键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。本次固定化酶使用的方法是包埋法，将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法成为包埋法。包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法为凝胶包埋法。本次实验中具体使用的方法为海藻酸钙凝胶包埋法。三、 实验仪器及材料1、 实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL6号针头、冰箱、其他实验常用玻璃仪器2、 糖化酶、海藻酸钠、明胶四、 试剂配方1、 2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉碎2g（预先10CTC烘干约2h至恒重），用少量蒸僧水调匀，徐徐倾入已沸的蒸偶水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml,此溶液需当天配制。2、 lmol/LpH4.5醋酸钠缓冲液取无水醋酸钠8.024g,先在少量水中溶解，定容至1000mlo取分析纯冰醋酸5.781111定容至1000mlo以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求的缓冲液。3、 0.05mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中。4、 0.1mol/L氢氧化钠溶液:称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000亳升。5、 1mol/L硫酸:吸取分析纯浓硫酸（比重1.84）55.5亳升，缓缓如入944.5亳升水定容至1000亳升。6、 0.1mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸僧水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。五、 实验步骤1、酶活测定⑴操作步骤取2%可溶性淀粉溶液25亳升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40°C恒温水浴中预热5-10分钟加入待测酶液2毫升（空白以蒸儒水代替酶液）准确计时1小时。取出加入4滴20%NaOH终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1mol/LNaOH10亳升，摇匀暗处静置15分钟。加入2N硫酸2毫升。用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠亳升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。⑵计算酶活（mg/ml）=（A-B）*N*90.05*V1/V2/V3*2A一空白所消耗的Na2S2O3的亳升数；B—样品所消耗的Na2S2O3的亳升数；90.05—1亳升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖亳克数；V1—反应液总体积（32.20毫升）；V2—吸取反应液样品体积（5毫升）；V3-吸取酶液亳升数（2亳升）；2—反应30min,换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数；N—Na2S2O3的当量浓度（0.1mol/L）。2、 米氏常数的测定取1ml游离酶,分别以0.20%,0.30%,0.40%,0.50%,1.00%,2.00%浓度的可溶性溶液为底物，在40C下反应lOmin,采用以上的方法测定游离酶活，做Lineweaver-Burk双倒数曲线图，即以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标。其斜率即为米氏常数。3、 糖化酶的固定化将酶液15ml游离酶与3%的海藻酸钠150ml混合，然后加入3%的明胶溶液150ml混合乳化约10min,调pH为4,慢速搅拌并降温至5〜10C,通过6号注射针头将上述冷却液以5cm的高度注进1%氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4°C,球在氯化钙溶液中被硬化30min,固定化酶被贮存在0〜5°C冰箱。4、 固定化酶的酶活测定⑴操作步骤取2%可溶性淀粉溶液25亳升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40C恒温水浴中预热5-10分钟加入固定化酶5g（空白以蒸儒水代替固定化酶）准确计时1小时。取出过滤终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5亳升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10亳升，再加0.1mol/LNaOH10亳升，摇匀暗处静置15分钟。加入2N硫酸2亳升。用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。⑵计算酶活（mg/ml）=（A-B）*N*90.05*V1/V2A一空白所消耗的Na2S2O3的亳升数；B—样品所消耗的Na2S2O3的亳升数；90.05—1亳升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖亳克数；V1—反应液总体积（32.20毫升）；V2—吸取反应液样品体积（5亳升）；N—Na2S2O3的当量浓度（0.1mol/L）。5、 固定化酶活力回收测定固定化酶活力回收=固定化酶总活力/溶液酶总活力X100%

6、固定化酶半衰期测定六、实验数据与数据处理1、表1糖化酶酶活测定空白硫代硫酸钠溶液消耗体积ml9.4样品硫代硫酸钠溶液消耗体积ml4.5酶的比活力u/g193122、表2糖化酶米氏常数测定底物浓度0.20%030%0.40%0.50%1.00%2.00%空白滴定体积ml8.99.09.08.959.058.9样品滴定体积ml8.37.97.87.56.45.45[S]mg/ml0.0160.0240.0320.0390.0780.1551/[S]64.441.6731.2525.7612.886.44Vmg/min34.7953263.7914269.5906484.08869153.6793200.07311/V0.02870.01570.01440.01190.00650.0050以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标，做Lineweaver-Burk双倒数曲线图，其斜率即为米氏常数。Km=O.0004/0.0015=0.267游离iWLineweaver-Burk图法求Km值图1Lineweaver-Burk双倒数曲线图3、

表3固定化酶酶活测定编号空白消耗体积样品消耗体积酶比活力u/g平均比活力u/g管19.057.857.857.85管29.007.807.854、固定化酶回收率的计算：100ml胶酶溶液相当的酶活力u=总的固定化酶质量X固定化酶比活力

=45.6X7.85=357.96(11)1殆、火油8+lOOm®酶溶液相当的酶活力身＜100315m1胶酶浴液相当于151111酶溶液活力u= x313100=357.96/100X315=1127.57u15ml酶溶液的总活力u=15ml酶溶液的总活力u=糖化酶的比活力X酶粉质量m100=19312/100*15=2896.8u固定化酶的回收率3%=xlOO%330ml胶酶溶液相当于15ml酶溶液酶活力

15ml固定化酶的回收率3%=xlOO%=1127.57/2896.8X100%=38.9%5、固定化酶半衰期的测定表4固定化酶的半衰期测定表格时间质量gAB酶活力u/gLg活力059.057.857.850.8952459.008.155.560.745由下图得:tl/2=ln2/0.0068=110h（4天零14小时）

图2固定化酶半衰期的测定结果与讨论：本实验采用包埋法对糖化酶进行固定化并对其Km,半衰期t2/l重要参数进行测定，随着人们对天然高分子载体的不断挖掘和探究，对其进行改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶，同时，开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化和生产能力是固定化酶技术发展的趋势。以上实验得出实验数据如下:项目游离酶活Iv固定化酶活固定化酶半衰期固定化酶活力回收数据19312U/g0.267mg/ml7.85U/g110h38.9%误差分析：（1） 实验中要求采用的硫代硫酸钠溶液需放置三天才能使用，而我们没有做到这一点，这使结果发生偏差。（2） 由于在测固定化酶的活力过程中，固定化酶微球会浮在反应液表面