实体肿瘤DNA倍体的FCM分析课件

实体肿瘤DNA倍体的

FCM分析

一、DNA倍体研究的理论依据

G0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止期细胞，其细胞DNA含量为较恒定的2C值。

G1期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环的一群细胞,G1期细胞与

G0期细胞DNA值相同，均为二倍体DNA含量。

细胞进入S期后DNA含量值逐渐增加，从

2C值-4C值直到细胞DNA倍增结束，进入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C值，即为四倍体细胞群。荧光染料与细胞DNA具有特异性结合，且有一定量效关系，即1.DNA含量的多少与荧光染料的结合成正比。2.荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比。3.荧光脉冲与组方图的通道值成正比。因此，FCMDNA定量分析一个细胞群时，可将二倍DNA含量分布组方图分为三部分，即GO/1，S，G2M.。G0/1和G2M细胞峰DNA的分布均成正态分布。S期可以认为是一个加宽的正态分布。二、DNA含量的表示方法FCM定量分析一个细胞群，其DNA含量值是以DNA指数(DNAindex:DI)表示其相对DNA含量的。一个正常的二倍体细胞峰，其G0/1期细胞DNA含量为2C，DI值为1.0，G2M期细胞DNA含量为4C，DI值为2.0。

实验样品细胞G0/1峰的均道值

DI=-------------------------------------------

正常细胞G0/1峰的均道值例如，如果一个未知DNA含量的细胞群GO/1期细胞峰的均道值在60道，正常二倍体标准细胞GO/1峰均道值也在60道，那么，这个未知DNA含量的细胞群DI=1.0。如果一个未知DNA含量的细胞群GO/l峰均道值在90道，DI=1.50。

三、DNA倍体的判定标准DNA倍体的判定是根据所测细胞群DNA含量分布组方图G0/1峰的DNA相对含量值，即DNA指数值进行判定的，从理论上讲，二倍体的DI值应为1.0，四倍体的DI值应为2.0,但实际所测DNA含量的组方图的G0/1峰是个正态分布，测定过程中就有存在一定的漂移，为精确的解释这种漂移现象，FCMDNA定量分析引入了变异系数又称CV值，用CV值可以定量解释这种实测过程的漂移现象.实测结果的CV值一般要包括两部分，即仪器准直的CV值和实验样品的CV值.然而CV值常受到样品所固有性质的一些影响，CV值的大小常与样品的物理，生化性质有关，也与样品处理方法，荧光染色等有关。例如正常人的皮肤二倍体细胞DNA组方图的CV值与正常人淋巴细胞DNA组方图的CV值存在明显差异，淋巴细胞DNA含量均质性较一致，皮肤上皮细胞DNA均质性差异较大。在使用CV值时，不能把一个DNA量分布不均质的细胞群作为衡量精度的标准CV值，也不能使用一个非生物样品(例如荧光微球)作为标准样品的CV值使用，它不能代表实验样品实测CV值。最好使用一些接近人类的正常细胞DNA含量的生物细胞作为标准细胞的CV值，要求这些生物细胞DNA含量均质性好，大小形态较一致(参见标准样品一章)。在实验过程中，一个生物标准细胞的CV值在

5%的精度就足够了，CV值可信限在8%以内，(但要视样品的固定方法和染色方法)。1984年国际分析细胞学会名词审定委员会对FCMDNA非整倍体作了建议:判定DNA非整倍体必须在DNA分布组方图上两个明显分离的G0/1峰，其中一个为明确的二倍体的标准峰位，但大多数作者报道DNA倍体是基于2个标准，即DI值和两个分离的G0/1峰DNA干系,Wersto等综述了文献报道中对DNA倍体判断的标准，见下表：表SurveyoftheparametersusedtoclassifyDNAHierogramsasploidy1990年第十四届国际分析细胞学学术会上，进一步说明了DNA非整倍体具有两个分离的G0/1峰，并依据DI值判定DNA倍体。DNA倍体的判定基本上规范在如下的标准：

以二倍体参考细胞G0/1期细胞DNA含量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体细胞的CV值在5%，判定标准即：

DNA二倍体＝2C士2CV值

DNA异倍体≠2C士2CV值即DI＝1.0士0.1

(0.9－1.10)为二倍体

DI＝1.0士0.15

(0.85－1.15)为近二倍体

DI=2.0士2CV(1.90－2.10)为四倍体

DI>2.10多倍体

其余DI值均为非整倍体在计算DNA异倍体时，把近二倍体，多倍体，四倍体，非整倍体划为异倍体(Heteroploid)的范畴。四、DNA倍体的命名原则

染色体核型方法时，应命为染色体倍体分析(chromosom

ploidanalysis)

如染色体整倍体(chromosomeeuploid)，染色体非整倍体(chromosomeaneuploid)或常简称为整倍体或非整倍体，也可将染色体二倍体称为2N，四倍体称为4N。

用静态的显微光度术，显微图像分析技术时，命名为静态DNA倍体分析(staticDNAploidanalysis)用流式细胞术测量时,命名为流式DNA倍体(FlowDNAploidanalysis)，如流式DNA二倍体(FlowDNAdiploid)，亦可称为2C。流式DNA四倍体(FlowDNAtetraploid)亦称为4C。

五、DNA组方图的倍体类型自流式细胞术被引入肿瘤研究以来,已经对各类型新鲜肿瘤组织和石蜡包埋肿瘤组织进行DNA倍体的定量分析,为研究肿瘤DNA含量的分布状态,提供了非常直观的参考信息,DNA组方图常见的类型以单一DNA干系多见,说明肿瘤的发生多以单一细胞克隆发生而来,我们对3050例恶性肿瘤DNA倍体分析所见,以单一DNA干系的组方图占80-90%左右,双干系或多干系的DNA组方图较少见。DNA含量检测结果报告报告中至少应包含以下信息:(1)DNA倍体,包括所有群体的DI；(2)主要G1峰的CV；(3)S期比例；(4)必要的简单评价：如细胞数的不足、碎片较多、CV太高等。

六流式细胞术在泌尿系肿瘤中的应用㈠膀胱癌⒈FCM与膀胱癌的诊断：

应用尿液作FCM检测诊断膀胱癌是否可获得满意结果尚有争议

经膀胱镜或尿管冲洗膀胱所获标本含细胞数较多，可提供良好的FCM检测标本，但需受器械检查之苦，尤其在随访中需多次留取标本，病人往往难于接受，所以，唯新鲜尿标本才是真正的非侵入性检查方法。

White等曾报告86例膀胱肿瘤患者的尿液和膀胱冲洗液作FCM检测，94%的尿液标本和97%的膀胱冲洗液得到了满意的图形。Pritchete等亦采用新鲜尿与膀胱冲洗液标本，发现两者在图形显示及肿瘤检出率方面无明显差异。作者曾对l01例膀胱肿瘤患者作FCM检测，其中78例取300-500ml新鲜尿液，23例取膀胱镜冲洗液，结果发现肿瘤检出率分别为84.61%和86.95%，两组数据经统计学处理无明显差异。作者认为，新鲜尿标本适用于做FCM标本，对标本细胞数少，图形不满意者，可取膀胱冲洗液。

膀胱冲洗液的收集

经膀胱镜或尿导管向膀胱内加压注入生理盐水100-200ml，反复抽吸3-4次，收集的冲洗液应立即放入4℃冰箱内冷藏，存放时间不应超过24小时。若标本中含红细胞，可采用加蒸馏水的低渗方法去除。将收集到的膀胱冲洗液离心后，PBS缓冲液冲洗2次，用细尼龙网过滤以去除标本中杂质或细胞团块，离心弃上清液后用70%酒精固定，放－10℃冰箱贮存，最长贮存时间可达6个月。

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其癌细胞的分裂增殖能力异常活跃，细胞的DNA含量多有不同程度的增高，表现为二倍体和异倍体等，异倍体肿瘤的浸润、转移、复发以及临床预后等方面均较二倍体、近二倍体肿瘤更突出的恶性生物学行为，因而不论膀胱癌分级、分期如何，其瘤细胞DNA含量表现为异倍体者均可视为高危人群病人。

FCMDNA诊断膀胱癌的标准：①出现与正常二倍体峰明显分离的异倍体或近二倍体波型。②高倍体细胞比值<15%伴明显四倍体细胞组成的波型。③G0/l波型变异系数<9%。可疑：无明显异倍体细胞群，超二倍体细胞群大于10－15%之间。阴性：二倍体分布，超二倍体细胞<10%。

注：异倍体波型包括非整倍体、多倍体和高四倍体。近二倍体是指DI在1.11－1.15范围内的G0/1期细胞组成的异常波型。

FCM诊断膀胱癌有较高的敏感性和特异性，其阳性率与肿瘤的病理分级和浸润深度呈正相关。Klein对194例膀胱癌冲洗液作FCM测定，FCM平均肿瘤检出率93%。作者曾对

101例膀胱癌作新鲜尿液和膀胱冲洗液FCM测定。表浅癌组织58例(TA)，异倍体24例(41.38%)，FCM检出阳性率79.3I%，浸润癌组织43例(T1-T4)，异倍体37例(86.04%)，FCM阳性率95.34%。由此可见，低分期、分级膀胱癌，FCM异倍体率低，而高分期、分级肿瘤，FCM肿瘤检出率及异倍体率明显增高。

FCM对肿瘤检出率较高是由于

:①FCM能够将细胞形态尚没有特征性改变而核内

DNA含量有异常增加的瘤细胞检测出来。②发生变性的瘤细胞由于形态改变,在尿细胞学检查不能得到确诊，但其细胞核DNA分子尚无降解破坏，因此，FCM仍能测得。③FCM通过细胞DNA含量和细胞动力学等多种指标对肿瘤细胞进行判断，具有客观性强，灵敏度高等优点。④FCM及尿细胞学两种方法都有一定比率的假阴性和假阳性病例，FCM出现假阴性常由一些二倍体肿瘤，对于假阳性的病例，常由于一些严重感染的泌尿道炎症，但仍要做认真的随访，所以，可将两种方法联合应用，相辅相成，可望使诊断率，进一步提高。2.FCM在膀胱癌术后随访的作用：FCM特别适用于膀胱肿瘤的术后随访，膀胱镜检和尿细胞学均阴性者，FCM仍可显示肿瘤阳性。Klein等观察21例此类患者，除FCM检出肿瘤阳性外，其他方法均未发现肿瘤，随访2-I2个月，有11例出现肉眼可见肿瘤。该作者认为FCM能在出现肉眼可见膀胱肿瘤之前12-18个月时测出异常。

王泽等应用FCM对膀胱癌术后病人进行检测，发现在FCM阳性而膀胱镜检查阴性者，约78%的病例经过3－25个月后作膀胱镜证实肿瘤复发，而FCM和膀胱镜检查均阴性的病例，再次膀胱镜检查诊断为肿瘤复发者仅3.7%。这提示膀胱冲洗液FCM检测，在诊断膀胱肿瘤复发上明显优于膀胱镜检查，是膀胱癌术后监测较为理想的方法。3.判定膀胱癌的恶性程度：膀胱癌异倍体发生率与膀胱癌的分级和分期均显著相关，即随着肿瘤病理分期或分级的进展，异倍体肿瘤的检出率逐渐增高。Lemblomions等发现病理分级Ⅱ级DNA二倍体组五年生存率为85%接近分级I级膀胱癌。而病理分级Ⅱ级异倍体组5年生存率为50%，两者有显著差异。这一方面表明膀胱癌细胞DNA含量的异常，虽为同样组织分级的肿瘤，但其生物学特性及自然转归可能不同，另一方面也反映出光镜下病理分级的不足及DNA含量分析的重要价值。

有作者对142例FCM结果显示，42例病理分期为T0和T1肿瘤中，81%为二倍体，而98例T2、T3和T4期肿瘤，77%表现为异倍体，特别是T4期肿瘤全部为异倍体。随着病理分期的增高，不但异倍体肿瘤的检出率增加，而且异倍体肿瘤的DNA倍体类型也发生明显变化，四倍体肿瘤的检出率逐渐下降，非整倍体的检出率逐渐上升。上述现象提示肿瘤在其发生、发展过程中可能存在一种特定的规律，即肿瘤细胞DNA倍体类型按照二倍体→四倍体→单异倍体→多异倍体的生物模式发生变化。

以上结果表明：

FCMDNA倍体分析可作为一种有较高价值判定膀胱肿瘤恶性程度的手段。

几乎所有的高分期、高分级膀胱癌为异倍体，具有较高的恶性程度，肿瘤细胞增殖旺盛，

低分级、表浅癌者多为二倍体及近二倍体，恶性程度较低，瘤细胞生长缓慢。

4.预测膀胱癌的复发和预后：FCM可用来监测膀胱癌患者并根据瘤细胞DNA含量的变化对预后作出推断，与肿瘤的分期和分级互为补充，成为重要的预后指标之一。有作者对165例膀胱癌行FCM检测，发现75例二倍体肿瘤有14例(18%)肿瘤复发，90例异倍体肿瘤有69例76.7%）肿瘤复发，后者为前者的4.1倍。对上述165例膀胱癌患者随访，目前存活94例(57%)，死亡71例(43%)，在75例二倍体肿瘤中，死亡者10例(33%)，平均存活时间为42个月，90例异倍体肿瘤死亡61例(67.8%)，其中四倍体肿瘤死亡14例，占其总数的50%，平均存活时间为21.3个月，多异倍体肿瘤11例全部死亡，平均存活时间为13.4个月。Gustafson等对222例表浅性膀胱癌作FCM分析，根据瘤细胞DNA含量不同将病人分为2组，结果发现：异倍体组的肿瘤复发率比二倍体组高出2倍。Tribukait的研究结果表明，二倍体肿瘤、四倍体肿瘤、单异倍体肿瘤和多倍体肿瘤的五年生存率分别为91%、83%、59%和30%以上。以上结果显示，二倍体膀胱癌患者的预后明显优于异倍体肿瘤患者，异倍体的出现预示肿瘤复发率高最终将发展为浸润性病变，是预后不良的征象。在异倍体肿瘤中，四倍体肿瘤患者的预后相对较好，非整倍体肿瘤患者的预后较差，尤其多异倍体患者的预后最差。

5.指导膀胱癌的治疗：FCM可以监测膀胱内灌注化疗药物的治疗效果，治疗有效时膀胱癌的异倍体肿瘤消失，二倍体细胞重新出现。一组36例膀胱癌资料表明：未经膀胱内化疗者异倍体率为100%，而治疗组仅47%可测出异倍体。Habjis-stirous

等对24例多发性表浅膀胱癌采用丝裂霉素C膀胱内灌注，并于用药前后多次取尿液或膀胱冲洗液行FCM连续测定，19例无复发者，细胞内DNA含量由治疗前的异倍体转变为二倍体分布，而5例6个月内复发者，则呈持续异倍体。FCM检测DNA倍体的异常变化早于能观察到复发迹象的任何其他方法，因而可筛选出对膀胱内化疗无效者并及早改行根治性治疗。FCM灵敏度较高，可根据测定结果确定有效药物，调整用药剂量和选择化疗最佳时机。6.双参数标记染色法在膀胱癌的应用：有作者对抗膀胱癌单克隆抗体和瘤组织DNA成分行双标记染色，并作FCM检测，根据DNA含量及肿瘤相关抗原的出现对肿瘤的生物学性质进行评估，由于单抗仅与肿瘤细胞相结合，特异性高，故此法完全去除标本中混杂的炎性细胞对检测结果的影响，使一些少量的异倍体细胞(用FCMDNA单染色法可忽略)能够检测出来，使肿瘤诊断率明显提高。此外近来一些特异性较强、有针对性的抗膀胱癌单抗的出现，除可用于膀胱癌的诊断外，还可提供有关恶性程度、侵袭能力及预后等更多有价值的信息。㈡肾细胞癌FCM分析

肾细胞癌的预后很差，根治性肾切除后仍有50%的患者死于转移。肿瘤的分期、分级虽为重要的预后指标，但尚不能反映肾肿瘤的生物学行为。许多研究表明，瘤细胞DNA倍体与肾癌的病理分级、临床分期、细胞类型、转移和预后有密切关系，可作为一项稳定的肿瘤生物学指标，可单独用来估计预后。肾细胞癌的临床分期和病理分级与DNA倍体具有相关性。二倍体或近二倍体患者多为局限于肾脏早期病变，病理分级较低(Ⅰ-Ⅱ级)，转移发生少，存活时间长。呈异倍体分布者，常为高分级肿瘤(Ⅲ-Ⅳ级)，较早出现转移，存活时间短。原发性肾癌和转移性肾癌的DNA倍体特别令人注目，在转移性肾癌中约40%的DNA倍体特性不同于原发性肿瘤。Tribuhit指出转移性肾癌细胞DNA倍体特性也具有判断患者预后的意义，故建议对转移性肾癌开展DNA倍体检测。该作者认为，对二倍体转移性肾癌除进行肾切除外，应尽量清除肉眼可见的转移灶，对异倍体转移性肾癌患者则不必考虑肾切除术。

尽管影响肾癌预后的因素很多，但作为一种独立的预后参数或与其他临床或病理形态参数相结合来估价肾癌预后，倍体水平所具有的作用是其他参数不能代替的。

㈢前列腺癌Forhom

等采用FCM分析了72例前列腺癌患者，发现异倍体肿瘤37例，无论采用何种治疗均死于3年随访期间(平均生存32.4个月),二倍体肿瘤35例，除3例死于3年内，其余患者均生存8年以上。Tribukait

观察80例前列腺癌骨转移者，76%的病人为异倍体。以上结果表明：前列腺癌DNA倍体与肿瘤的分期、分级和预后有重要关系。二倍体前列腺癌多为局限于前列腺包膜内的肿瘤，转移发生率低，预后良好，异倍体前列腺癌，提示肿瘤已浸出前列腺包膜之外，且2/3已存在盆腔淋巴结转移，因而预后不良。

七、FCM在妇科肿瘤的应用

㈠宫颈癌DNA倍体分析1.FCMDNA倍体分析有助子宫颈癌早期诊断：

鲍氏等对取自阴道检查患者脱落细胞样品34例，分别作细胞学、病理学及FCM检查测定。按细胞学结果分为三组。Ⅰ组：巴氏I-Ⅱ级，Ⅱ组：巴氏Ⅲ级，Ⅲ组：巴氏Ⅳ－Ⅴ级。Ⅲ组经病理诊断为鳞状细胞癌，DNA倍体均为非整倍体，Ⅰ、Ⅱ组29例的DNA含量均为二倍体。其DI和S+G2M值在正常范围，炎症和不典型增生之间有交叉现象。而Ⅲ

组宫颈癌DI或S+G2M值均无交叉，细胞增殖指数(PI)显著增高，Ⅱ

组PI值比I组高2.3倍，Ⅲ组比Ⅱ组PI值高2.8倍，比I组高6.5倍。资料表明，非整倍体及细胞增殖指数增高是宫颈恶性病变的标志。FCM测定宫颈脱落细胞DNA含量为宫颈癌早期诊断的一个新方法。2.DNA含量与预后：Strang等对159例宫颈鳞状细胞瘤患者进行FCM分析表明，非整倍体及S时相率升高与具有浸润性组织病理特征的肿瘤相符，从临床分期和DNA含量来看，随着临床分期的增加，高倍体(Highploidy)肿瘤的比例也增加。肿瘤大小、病理类别和DNA指数的关系，未见到其间有明显的相关性。Jakobsen对DNA倍体与宫颈癌预后的关系作了研究。结果提示，DI值与生存期显著相关。DI大于1.5治疗易失败，DI<1.5存活率高。吴爱茹等研究结果指出，在DI≤1.5的60例中，仅8例死于癌；而DI>1.5的18例中则有5例死于癌，两组有显著性差异。FCM测定宫颈癌DNA含量显示，在I期子宫颈癌患者中，肿瘤细胞DNA含量与其复发率，生存率密切相关。但临床分期、肿瘤大小、病理分类、淋巴转移与肿瘤细胞的

DNA含量无明显相关性。

㈡DNA检测在子宫内膜癌中的意义

1.子宫内膜癌的DNA倍体分析：Atkin

和Hastir1等认为，大多数宫体腺癌为DNA二倍体，他们用FCM分析57例宫内膜癌病人，38例(73%)是二倍体，14例(27%)是非整倍体，DI值在1.65-2.34。8例转移癌中5例(63%)是非整倍体，其中2例伴有腹水，在腹水中的肿瘤细胞DI值和原发癌相一致。Moberger

对37例存活8年以上和34例生存期低于2年的宫体癌进行DNA分析，发现2年内死亡的82%是非整倍体，这预示着非整倍体病人预后差，生存期短，中等分化和分化良好的肿瘤非整倍体者死亡率高于同级别的DNA二倍体病人。

2.宫体癌DNA倍体与临床分期的关系：Iversen

认为Ⅰ期(31%)和Ⅱ期(17%)宫体癌中，非整倍体的频率没有显著差异。39个I期病人中8个(12%)是非整倍体。而10例Ⅲ－Ⅳ期患者中，5个是非整倍体，Ⅲ－Ⅳ期非整倍体率高。

3.DNA倍体和组织分级的关系：Iversen报道30例中，Ⅰ级分期腺癌至Ⅲ级分期的腺癌，其DI值从1.1增加到1.47-1.69差异是显著的。而Ⅰ级和Ⅱ级，Ⅱ级和Ⅲ级之间的差异则不太显著。据报道，约1/3的子宫内膜癌具有非整倍体。与卵巢癌、宫颈癌相比发生非整倍体率要低，转移癌的非整倍体发生率高于无转移病例。而非整倍体患者的死亡率明显高于二倍体。DNA含量值可做为子宫内膜癌的一项重要指标。这项检查将在子宫内膜癌的预后方面更有意义。

㈢滋养叶细胞肿瘤DNA含量分析

庄桂霞等对64例葡萄胎(恶性及未恶变者各32例)用FCM测定DNA含量，如下表：由表12中可以看出未恶变与恶变者非整倍体率分别为34.4%和59.4%，差异有显著意义。若以DNA非整倍体作为一项指标来判断葡萄胎恶变，符合率为59.4%，赵彩彦等检测12例葡萄胎，其中3例非整倍体中2例恶变(66.7%)。在上组病人中，恶变者32例只有2例病理为滋养细胞重度增生。而未恶变从滋养细胞增生程度来考虑并不完全可靠。由此认为，DNA非整倍体预示葡萄胎的恶变倾向，DNA定量分析可以作为其恶变的一项监测指标。有作者用FCM分析成功38例(绒癌14例、恶葡12例、良葡12例)。所有样品DNA直方图均为单峰分布。从表13显示，可见绒癌和恶葡的异倍体发生率无显著差异(P>0.05)二者均明显高于良葡。

从表14可以看出，随肿瘤恶变程度的增加G0/G1期细胞比例逐渐减少，而增殖细胞S十G2M比例逐渐增加。绒癌和恶葡无显著差异，二者与良葡有显著差异，临床晚期的绒癌和恶葡异倍体发生率(93.3%)高于临床早期(72.7%)。

DNA倍体与预后：14例绒癌中12例异倍体，平均生存期<60个月。2例二倍体者均存活120个月以上。恶葡中2例生存期少于60个月者为异倍体。表明DNA异倍体绒癌恶葡的恶性程度高，患者年龄、病因等诸多因素也影响着疾病的程度和发展。DNA倍体的测定与这些因素的关系也是相关的。总之，FCM测定滋养细胞肿瘤DNA含量，可以预测葡萄胎的恶变倾向。判断绒癌、恶葡预后及生存期的长短。为及时发现葡萄胎恶变和治疗绒癌、恶葡提供有价值的资料，以便适度掌握化疗疗程、减少并发症，提高生存率。

㈣卵巢肿瘤DNA含量分析的临床意义1.DNA倍体与卵巢肿瘤的关系：应用FCM研究发现卵巢良性肿瘤均为二倍体。Barlogic

研究大量人体各部位良性病变均为二倍体，Fridiander

分析44例卵巢交界性上皮瘤，其中42例为二倍体且预后良好。卵巢癌的异倍体率在52-81%间不等。卵巢癌的DI大多位于3-4倍体范围。实体瘤DNA分布从亚二倍体到超八倍体不等。反映了肿瘤的异质性。一些作者还发现卵巢癌中多克隆异倍体组方图出现一个以上异常的G0/Gl峰的存在。

2.DNA倍体的稳定性：有作者对卵巢癌原发瘤多点取材，结果DNA含量无变化。对照分析卵巢癌原发瘤与转移瘤的DNA含量，不随取材部位变化。说明倍体具有稳定性，但组方图中细胞比例有所变化。这可能是正常和异常细胞混合比例不同及肿瘤本身异质性所致。一些作者分析化疗复发肿瘤的DNA含量，并未受化疗药物的影响。也表明倍体具有时间上的稳定性。同时也说明这类肿瘤对化疗不敏感，预后不良。Dobash应用计算机图象分析仪研究。发现卵巢癌化疗后DNA含量呈下降趋势，而且DNA含量下降明显的患者预后较好。

3.DNA倍体与临床及组织学间的关系：卵巢癌DNA倍体与临床期别的关系有两种结果。一种认为无关，一种认为有关。即晚期癌的异倍体明显高于早期。卵巢癌异倍体的出现与患者年龄、腹水及瘤体大小的关系尚不明确。卵巢癌的倍体分布与组织学类型无关，但与组织学分级显著相关。高分化癌多为二倍体，低分化癌多为异倍体，中分化癌的倍体分布占于中间。子宫内膜癌、宫颈癌、乳癌的研究也发现类似情况。这表明DI值与组织级别呈正相关。

4.DNA倍体与预后的关系：目前普遍认为卵巢癌的预后与临床分期、组织类型、组织学分级、腹水存在与否，术后残余瘤大小等因素有关。但各种因素的相互关系不清楚。而应用FCM对卵巢癌的研究，可为预后提供新的参数。许多研究应用多变量分析表明DNA倍体状态是晚期卵巢癌的重要预后参数。即二倍体卵巢癌的预后明显优于异倍体。卵巢癌中多克隆异倍体的出现预示高度恶性，其预后与单克隆异倍体明显不同。其原因可能由于基因组合不稳定，多个幼稚细胞系的存在及抗药细胞克隆的发展。

5.S期细胞比率与卵巢肿瘤的关系：细胞核含量随细胞周期不断变化，G0/Gl期核DNA含量为2C，G2M期为4C，S期核DNA含量介于2-4C之间，快速进行细胞周期分析，标准细胞群分为G0/Gl、S、G2M期三部分。其中S期细胞比率(S-PhasefactionSPF)常用于实体瘤来表示肿瘤细胞的增殖特性。卵巢癌异倍体的SPF明显高于二倍体，与大量实体瘤的FCM周期分析一致。卵巢癌二倍体SPF明显高于良性肿瘤二倍体与稳定的DNA倍体不同。SPF在肿瘤不同区域有很大变异。但卵巢原发瘤与转移瘤的SPF无明显差异.由于峰的过度重叠，大约1/4-1/3的肿瘤无法精确计算SPF。SPF与卵巢癌的临床分期无明显关系，与卵巢癌组织类型也无关系，但与组织学分级、细胞分化显著相关。低SPF的卵巢癌预后明显好于高SPF的卵巢癌，这表明肿瘤由于增殖率的加快而呈高度恶性进展。细胞动力学的研究有助于选择合理的化疗方案。化疗药物对细胞增殖高度活跃的卵巢癌疗效明显。研究表明SPF为卵巢癌重要的预后参数。SPF与倍体状态结合起来综合评价卵巢癌预后，较两项指标单独应用更能反映其生物学行为。Kauionicmi依据SPF和DI将卵巢癌病人分为三组。高危组：多克隆异倍体或超四倍体同时SPF>16%低危组：二倍体同时SPF﹤9%中危组：其余

6.DNA非整倍体在卵巢交界性肿瘤的诊断价值:DNA非整倍体则是恶性肿瘤的一个标志。卵巢的大多数良性肿瘤DNA含量都是二倍体，若出现非整倍体，虽组织学还无恶性特征，但已具备潜在恶性变。Friedlader(1984)分析44例卵巢交界性肿瘤的DNA含量，结果42例(95%)为二倍体肿瘤，仅2例为非整倍体肿瘤，对后者进行复查，均已发现肿瘤侵犯腹膜及网膜的种植瘤结，其中1例患者术后7个月死亡。42例DNA二倍体的交界瘤，经随访3－13年，均未复发或致死。故认为交界瘤DNA含量呈非整倍体具有恶性肿瘤特征及浸润性生长的特性，故可视为对病理诊断的一个补充，有利于及时制定正确的防治措施。

7.卵巢肿瘤FCM分析与临床应用前景Friedlander等对卵巢交界瘤的研究，发现DNA异倍体的交界瘤预后差。其中l例在初诊后7个月内死于肿瘤播散。认为交界瘤出现DNA异倍体，已具有恶性肿瘤的特性。对于病理学上难以区分良恶性的卵巢交界性肿瘤，FCM可提示其潜在恶变趋势，有助于对肿瘤的生物学行为作出判断，并有助于患者的治疗及预后预测。八、FCM在脑肿瘤中的应用

有作者对神经母细胞瘤石蜡包埋组织细胞DNA含量进行FCM分析,提示随着临床分期的增高，异倍体出现率有增多的趋向，Ⅳ期异倍体高于Ⅱ、Ⅲ期，异倍体肿瘤组S、G2M期百分比明显高于二倍体组，随着临床分期的增高，异倍体出现率明显增加。对60例星形细胞瘤DNA含量和S期细胞进行分析，二倍体和近二倍体肿瘤24例，

DI=1.10±0.08，S=(16.4±3.6)%非整倍体肿瘤36例，

DI=1.45±0.28，S=(21.7±3.7)%

二倍体和近二倍体肿瘤DI值S期，细胞与非整倍体肿瘤相比，统计学上有非常显著差异，其组织学分级与DNA含量和S期时相分布有明显相关性，随分级的增高，DI值和S期细胞亦增高。在有随访结果的46例的肿瘤中，DNA指数分别为DI<1.30和DI﹥1.30两组。DI<1.30的22例，平均生存期为41.6±7.4个月，DI>1.30的24例，平均生存期为36.2±11.2月，两组生存期有显著差异，22例生存期长的病人，S期细胞百分比为16.4±3.7，24例生存期短的病人，S期细胞百分比为18.2士4.6。提示：肿瘤细胞DNA含量和S%与恶性程度、组织学分级有密切关系，随着组织学分级的增高，DI值和标志着肿瘤增殖活性的S期细胞亦增高。

有人对46例脑星形细胞瘤癌基因rasp21蛋臼产物表达和DNA含量进行流式定量分析，结果表明脑星形细胞瘤的DI值和P21FI值及DNA异倍体的出现率分别随组织学分级的升高而升高。P21阳性率和异倍体出现率分别为50%和71.74%。DNA异倍体肿瘤P21性表达率(分别为19.1%和20.9%)肿瘤细胞分化程度与P21表达密切相关。分化I级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤，P21阳性表达率分别为13.04%、17.4%、56.52%、63.04%提示随组织学分级的增高，P21阳性表达率也增高，随访资料亦提示DI值高和P21表达阳性患者愈后差，生存期短。九、恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析

㈠何杰金氏淋巴瘤Anastasi等以多参数FCM对15例Hodgkin‘s淋巴瘤细胞DNA含量分析,结果发现抗核仁抗体强阳性的细胞核中可见少数DNA异倍体细胞群，每一病例异倍体细胞群为2-4个。但若进行DNA含量单参数分析，15个病例中仅1例可见DNA异倍体。检测出的DNA异倍体干系，6例为亚二倍体或亚四倍体、7例为超二倍体、2例为近三倍体。细胞分选发现，DNA含量4-8倍于正常DNA含量的细胞核多类似于典型的R－S细胞核，而近二倍体或近三倍体细胞核所相应的细胞在组织学切片上尚难以确认为其是肿瘤细胞。Brdkamp等以多参数FCM分析方法对137例Hodgkin‘s淋巴瘤的DNA异倍体进行了研究，137个病例中有67例(49%)可见DNA异倍体，其中24例只有用双参数分析方法才能发现。DNA指数0.69-1.89不等，其中24例为亚二倍体。在多数病例中异倍体细胞核的数目,RS细胞和Hodgkin细胞在肿瘤中所占的比例提示：Hodgkin‘s淋巴瘤中的恶性细胞并不仅仅限于传统上所认为的RS/H细胞。作者进一步以ICH方法和FCM方法对比研究发现Hodgkin's淋巴瘤中DNA异倍体细胞在形态学上多为RS/H细胞或中等大小的具有淋巴细胞形态的细胞。㈡非何杰金氏淋巴瘤NHL细胞

FCMDNA异倍体的检出率

19%到

76%不等，多数学者认为与分型及预后无关，但亦有学者认为与治疗反应有一定关系。而SPF则是NHLFCMDNA分析中最有意义的参数，SPF的高低与肿瘤分型、病人存活时间的长短密切相关。1987年Wain等对106例NHL的免疫表型和DNA含量进行了对比研究，结果表明，B细胞NHLDNA异倍体与表型无关，但其DNA异倍体率较T细胞NHL高。T细胞NHL和B细胞NHL的SPF无差异。Young对111例NHL的分析显示，异倍体的出现率与病人年龄、肿瘤分期及存活时间无关。56例二倍体NHL的SPF值低于10%者预后较好。

Christensson等通过对234例未经治疗的NHL病人的活检材料进行FCMDNA分析，发现高度恶性NHL的SPF明显高于低度组。组织学分化程度高、SPF低(<5.6%)的病人获得完全缓解(CR)的机率较SPF高者高。在低度恶性NHL组中，DNA异倍体者对治疗反应差、CR时间短，但S期值与治疗反应无关。SPF与淋巴细胞型和滤泡中心细胞型NHL病人的存活有关但与淋巴母细胞型者无关。

左连富等分析了32例NHL的DNA含量，发现NHL的DNA非整倍体率为53.2%，显著低于其他恶性实体肿瘤，非整倍体的出现率随NHL的恶性度的增高而增加。NHL细胞SPF随NHL的恶性度的增高而增高。吴焕明分析了FCMDNA检测在判断NHL预后方面的意义，发现47%NHL病例可见DNA异倍体，其中，中高度恶性者异倍体出现率分别为51.9%和76.8%，明显高于低度恶性的17.6%，SPF随肿瘤恶性程度的增高而增高，DNA倍体状态与存活率无关，但SPF与存活率密切相关。Cowan等研究显示，倍体状态与组织学亚型(Kiel或Rappaport分型)、

Arbor分期及肿瘤部位无关，不同倍体的肿瘤对治疗的反应率、无复发存活时间及总存活率均无明显差异。PI与Kiel分型各组织学亚型密切相关。PI低于20%的病例完全缓解率(CR)明显高于PI>20%的病例（71%vs49%）。但多参数分析显示DNA异倍体和PI对治疗、反应、无复发存活时间及总存活率均无独立预后意义。Macartney

对83例滤泡性NHL进行了FCMDNA分析，发现DNA异倍体罕见，且与存活时间和向高度恶性转化无关。肿瘤SPF增高者病人存活时间缩短而且肿瘤在复发时向更恶性转化的危险增加。多因素分析结果表明SPF≥5%是滤泡性NHL决定存活时间最重要的因素之一。

Wooldridge等对48例弥漫性大细胞型NHL和4例弥漫性混合细胞型NHL的DNA含量和增殖活性与临床特征的对比分析，发现DNA异倍体率为56%，异倍体肿瘤的完全缓解时间明显延长。提出该类肿瘤低增殖活性和DNA异倍体的出现均是生存时间延长的标志。Cavalli等通过对107例NHL的DI和SPF分析认为细胞DNA倍体和增殖活性的测量就临床评价和预后判断而言并不会给现行的组织学分类方法提供更多的独立的信息。

值得注意的是NHLFCMDNA含量异质性问题，Cowan等对197例高、中度恶性NHLDNA含量和其预后意义及与临床病理的关系分析发现，16%肿瘤内不同部位细胞的DNA倍体存在明显差异，肿瘤内PI的变异在5%左右。Young等在48例DNA异倍体NHL中，也发现有3例为多异倍体类型。因此，在进行NHL的FCMDNA含量分析时，应考虑取材的广泛性和代表性，以期使FCM检测结果能充分反应NHL细胞DNA含量的全貌。Joensun等以FCM方法研究了37例NHL的生物进展情况，所有病例均在诊断后5个月到15个月重复活检，按WORKINGFORMULATION分类方法，在随访过程中，11例低度恶性肿瘤中有4例(36%)转化为中度恶性，16例中度恶性者有4例转化为高度恶性(25%)，上述8例发生转化的淋巴瘤中有5例在复发后18个月内死亡。不管是最初诊断，还是首次或末次重复活检，SPF均与预后密切相关，若重复活检SPF值比首次SPF值高6%或以上则预后差。少数异倍体肿瘤在重复活检时显示DNA二倍体。因此，该研究表明在恶性淋巴瘤的发展过程中，不但低度恶性淋巴瘤可转化为较高度恶性者，而且高度恶性者可转化为更恶性的形式，SPF在监视NHL的生物学行为方面具有应用价值，可提供一些单靠组织学研究所不能获取的信息。

Qiu等(I993)研究了FCMDNA分析在皮肤恶性淋巴瘤(CML)与假淋巴瘤(CPL)诊断中的价值,发现DI、PI及异倍体的出现均有助于CML与CPL的鉴别诊断。Pastel–Levy等亦发现FCMDNA异倍体在皮肤菌样霉菌病与皮肤炎症病变的鉴别诊断中具有重要价值。从技术方法的角度上，Lakkala等(1990)以FCMDNA异倍体分析方法与传统遗传学染色体核型方法对48例NHL进行了对比研究，发现尽管染色体方法显示92%(36/39)病例有染色体异常,但FCM分析仅19%病例可见DNA异倍体。因此，认为与染色体核型方法相比，FCM方法是一较粗的方法。1994年Gerison等对129例NHL的DNA含量进行了FCM和细胞遗传学对比分析，认为确定DNA含量较合理的方法是将上述FCM和细胞遗传学两种方法的研究资料综合分析，以DNA范围取代二倍体及异倍体的提法。Garcia鉴于若用石蜡组织进行FCM检测，另以新鲜组织进行染色体分析时，两种检查结果符合率较低(45%)，建议FCM和细胞遗传学检查必须用同一新鲜组织进行。

Zbieranowski

等以FCM和ICM方法对40例大细胞性弥漫型NHL进行了DNA倍体分析，认为当使用石蜡包埋的档案组织时两方法可互相补充，若ICM不在组织切片上测量时可漏掉异倍体细胞群。㈢多发性骨髓瘤Garcia等以分离细胞核PI染色和完整细胞CD38/PI双重染色FCM检测对156例多发性骨髓瘤(MM)的DNA异倍体的临床及预后意义进行了分析研究，发现两种技术方法在检测DNA异倍体方面相关良好。156个病例中，91例(58%)为异倍体(56%超二倍体，2%亚二倍体)。DNA超二倍体MM病人年龄低、贫血发病率低、G2M水平较低，而残留正常造血细胞增生活性强、浆细胞CD56表达增高、PBCD4+T细胞比例增高。与之相反，二倍体组MM病人CD10CD20和CD15表达增高、PBCD56﹢CD3–NK细胞数目增加。超二倍体组病人总生存时间比二倍体组明显延长。十、流式细胞术在软组织肿瘤的应用㈠单细胞悬液制备方法1.新鲜组织新鲜肉瘤组织分别以机械方法和酶消化方法进行细胞分散，检测发现机械法制备的样品检测CV(CoefficietofVariation)值较酶学法低，但获取细胞的数量和活性均不及酶学法。在各种消化酶中，胃蛋白酶、膜酶和透明质酸酶均无分散作用，只有胶原酶Ⅱ或胶原酶Ⅱ和透明质酸酶合用可取得良好的分散效果。胶原酶Ⅱ的使用浓度为5mg/ml，若将其提高至10mg/ml，获取细胞数量亦随之增高，但细胞活性下降，CV值增大。2.石蜡包埋组织：多数工作采用Hediey的方法，但由于肉瘤本身的特点，以石蜡包埋肉瘤组织进行FCMDNA检测，常出现较多的人工假象及错误，限制了其临床应用。研究发现，与新鲜组织明显不同，胶原酶对石蜡包埋肉瘤组织消化作用甚差，而膜酶和脯蛋白酶提取均优于胃蛋白酶，可使悬液中肿瘤细胞数增多，DNA检测结果与新鲜组织更接近。使用上述优化方法对50例软组织肉瘤进行了石蜡包埋组织与新鲜组织对比FCM研究，发现石蜡包埋组织DNA检测结果的错误率仍高于新鲜组织。㈡几种常见软组织肿瘤FCMDNA分析⒈横纹肌肉瘤：对70例石蜡包埋横纹肌肉瘤进行FCMDNA检测，发现其中23例显示DNA二倍体、32例异倍体、8例多倍体、7例四倍体。与其他肿瘤明显不同，异倍体横纹肌肉瘤预后最好，四倍体居中，二倍体及多倍体者预后最差。多因素分析结果表明，DNA倍体是与TNM分期和发生部位及组织学分级同样重要的独立预后判断因素。细胞增殖状态对横纹肌肉瘤的预后也有影响，S期细胞比率高于15%的32例中，仅10例长期存活，而低于15%的29例中有20例长期存活。

2.纤维组织来源肿瘤：结节性筋膜炎、纤维瘤病和纤维肉瘤均系纤维组织的瘤样病变或肿瘤。对9例结节性筋膜炎、20例纤维瘤病和19例纤维肉瘤的石蜡包埋组织进行FCMDNA倍体及增殖指数(ProliferationIndex,PI)分析结果表明，全部结节性筋膜炎和纤维瘤病均呈DNA二倍体，而19例纤维肉瘤中有5例出现DNA异倍体。纤维肉瘤的PI(28.1%)明显高于结节性筋膜炎(15.8%)和纤维瘤病(16.8-17.8%)(P<0.005)。作者认为，PI增高和异倍体的出现是纤维组织来源的肿瘤生物学行为恶性的重要标志。3.腱鞘及滑膜来源的肿瘤:对具有局部侵袭特征的7例弥漫型腱鞘巨细胞瘤和呈良性表现的11例局限型腱鞘巨细胞瘤及7例色素性绒毛结节性滑膜炎FCMDNA分析发现，7例弥漫型臆黯巨细胞瘤中有3例呈DNA异倍体，4例呈二倍体，而所有局限型腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎均为DNA二倍体。弥漫型腱鞘巨细胞瘤的PI值显著高于局限型腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎，后二者PI无差异。可见高的PI反映了弥漫型腱鞘巨细胞瘤的快速失控的生长特性及其侵袭性的生物学特性。Zaiupski

等研究发现作为腱鞘滑膜来源的恶性肿瘤，滑膜肉瘤中有33%表现为DNA异倍体。⒋胃肠道平滑肌来源的肿瘤：胃肠道平滑肌来源的肿瘤临床比较少见，良恶性质区分比较困难。Shinlamoto

等对43例胃平滑肌肿瘤DNA含量进行了FCM检测，结果发现，21例平滑肌瘤和9/10低度恶性的平滑肌肉瘤均为DNA二倍体，而高度恶性的12例平滑肌肉瘤中有10例为DNA异倍体。全部平滑肌瘤和8/11的二倍体平滑肌肉瘤未见复发和转移，相反，10例DNA异倍体平滑肌肉瘤中有8例死亡。表明DNA倍体与组织学特征和病人预后密切相关。SLImki等的研究则表明胃平滑肌肉瘤总的DNA倍体情况与临床病理特征无关，但异倍体与预后和分级相关。国内蔡建辉等对胃肠道平滑肌系统肿瘤进行了系统研究，发现良性平滑肌肿瘤细胞均为DNA二倍体，潜在恶性者33%病例出现DNA异倍体，而平滑肌肉瘤均为DNA异倍体。癌基因产物rasp21及抗癌基因p53的表达在平滑肉瘤明显增高。DNA倍体及PI与病人预后密切相关。5.血管来源的肿瘤：Fukunaga等以FCM方法对51例血管来源的软组织肿瘤石蜡包埋组织进行了分析，发现所有20例毛细血管瘤、2例梭形细胞血管内皮瘤和2例血管周细胞瘤均为DNA二倍体。20例血管肉瘤中13例为二倍体，7例为异倍体。5例恶性血管周皮瘤中，3例为二倍体，2例为异倍体。尽管所有良性和中度恶性的肿瘤呈现DNA二倍体，但血管肉瘤和恶性血管周皮瘤的组织学类型、DNA倍体和临床预后并无明显相关关系，因此FCMDNA检测在预测血管来源的恶性肿瘤的生物学行为方面的价值有限。

Eto等的研究结果亦表明67%的血管肉瘤和14%的血管周皮瘤显示DNA异倍体，而所有的良性血管肿瘤均为DNA二倍体。随访结果表明，临床呈良性经过的血管肿瘤细胞DNA为二倍体而多数预后差的肿瘤为异倍体。但FCMDNA倍体分析对血管肉瘤和恶性血管周皮瘤的预后判断没有价值。

6.kaposi肉瘤：Kaposi肉瘤一般可分为非洲地方性、经典性和与艾滋病相关性三大类，其来源尚有争议。kap-osi肉瘤的性质也不清楚。Biseeglia

等对96个病人的143例活检进行组织学和FCM研究结果表明，5.8%kaposi肉瘤显示DNA异倍体(DI1.4－1.6)，DNA异倍体在晚期病变较多见。Kaposi肉瘤平均S+G2百分率为16.8%，S+G2百分率在kaposi肉瘤早期斑块病变时较低，结节期则变化较大。提示细胞增殖状态在kaposi肉瘤的不同阶段可发生变化。然而，据目前的FCM检测结果并不能解决kapo-si肉瘤究竟是增生还是肿瘤的问题。

7.子宫肉瘤：Peters等对FCMDNA分析在子宫平滑肌肉瘤和潜在恶性的平滑肌肿瘤应用价值进行了探讨，FCM分析的33例平滑肌肉瘤中，14例为二倍体，19例为异倍体。两组病人的临床特征无明显区别。异倍体肿瘤更易于出现细胞异型性。核分裂数与SPF密切相关。二倍体肿瘤的总生存时间较异倍体肿瘤长，但无瘤生存时间则与后者无异。在最终复发的病例中，二倍体肿瘤从复发到死亡的时间明显延长。作者认为，就区分一个子宫平滑肌肿瘤的良恶性而言，DNA倍体分析和细胞增殖率的测量均无明显意义，但DNA倍体分析可预测肿瘤进展时的预后，而增殖率是判断总生存时间的最好指标。

除子宫平滑肌来源肿瘤外，子宫内膜间质肿瘤也较常见。Hitchcock等对22例子宫间内膜间质肉瘤进行了FCMDNA分析，并研究了其与外科分期、病理分级、核分裂指数及复发的关系。22例肿瘤中只有2例为DNA异倍体，均为晚期病人。细胞增殖状态与血管浸润、病理分级、核分裂指数或外科分级均无明显关联。但el-Naggar等通过对25例子宫质肿瘤的FCM分析则认为，FCMPI是判定早期子宫间质肿瘤的侵袭特征的客观的附加指征。Malmstrom等通过对37例子宫肉瘤的FCM分析，51%为DNA异倍体，其SPF比二倍体肿瘤高三倍，异倍体肿瘤比例与SPF值在晚期，分化低的肿瘤中明显增高，SPF和MI高者预后差，多参数分析表明，SPF是决定子宫肉瘤预后的重要因素。

8.其他：Ewing's肉瘤、上皮样肉瘤和乳腺叶状肉瘤的FCM结果表明，Ewing's肉瘤多为DNA二倍体，而上皮样肉瘤和乳腺叶状肉瘤均有较多的病例呈现DNA异倍体(7/11和24/60)，但DNA倍体与肿瘤生物学行为、临床表现及病人预后无明显关系。

㈢小结与展望众所周知，软组织肿瘤虽然临床上不甚多见，但其种类繁多，组织结构复杂，同一来源的肿瘤良恶性质有时很难区分，分化程度较低的肿瘤常难以确定其来源，某些良性的瘤样病变往往易被误诊为恶性肉瘤。因此，有时单靠病理形态学方法难以作出准确诊断。FCMDNA检测作为定量检测肿瘤细胞DNA含量与细胞增殖状态的方法，同样可应用于软组织肿瘤。业已证明，肉瘤细胞的FCMDNA含量和细胞遗传学染色体倍体具有良好的一致性。

据近年来软组织肿瘤的FCMDNA研究工作的情况综合分析，可见FCMDNA检测在软组织肿瘤研究领域，也具有相当重要的应用价值，DNA含量和细胞增殖状态的FCM分析有助于平滑肌、纤维组织、滑膜腱鞘及血管来源的肿瘤良恶性质的确定，并可作为肌源性肿瘤生物学行为和预后判断的重要依据。另外，以细胞增殖状态做为软组织肉瘤术前化疗的依据，可指导临床治疗。从目前的研究结果看，除肌源性肿瘤外，其余的软组织肿瘤的FCMDNA检测结果尚不能像多数上皮性恶性肿瘤那样作为判断预后的依据。软组织肿瘤的FCMDNA分析在下列诸方面亦有待进一步探讨与完善：1.针对软组织肿瘤种类繁多，组织结构与生化特征各不相同的情况，应进一步开展制样方法、尤其是单细胞悬液制备方法的研究，开发针对某一特定肿瘤的制样方法。2.克服、消除由于自溶、组织固定、染色等对FCMDNA检测结果的影响。3.增加每一肿瘤检测的样品数，在可能的情况下应从肿瘤的不同部位多点取材分析，以期增强检测结果的代表性，发现肿瘤内的不同细胞干系，克服由于肿瘤异质性(Hetero－geneity)所造成的片面分析结果。4.增加病例数量和随访时间，统一分析条件与标准，增强和扩大实验室间的合作。十一、骨肿瘤FCMDNA倍体分析㈠骨肉瘤Bauer等以FCM方法分析了原发性骨肿瘤细胞(高度恶性骨肉瘤，骨旁骨肉瘤和在组织学上易与骨肉瘤混淆的骨良性肿瘤)的DNA含量及其在该类肿瘤诊断和鉴别诊断方面的意义。在作者分析的166例骨肿瘤中，149例诊断明确，17例诊断困难，存在异议。诊断明确组织全部良性肿瘤和骨旁骨肉瘤均为DNA二倍体，而102例骨肉瘤中有97例为DNA超二倍体。

Alho对46例骨及软骨肿瘤进行FCMDNA分析，其中良性24例、低度恶性11例、高度恶性11例，异倍体检出率分别为29%、54%、82%，良性肿瘤SPF均<14%，而低度恶性者3/11病例>14%，高度恶性者9/11病例>14%。因此，认为异倍体出现及高增殖活性是骨肿瘤恶性的特征。Look等通过对临床诊断时未发现有肿瘤转移的26例骨肉瘤进行FCMDNA检测，发现25/26病例均可检出超二倍体干系，但其中15例可见近二倍体干系与之同时存在。经三年随访，具有近二倍体干系的15例中仅2例发生肺转移，而无近二倍体干系仅有超二倍体干系的骨肉瘤70%(7/10)发生肺转移。因此认为，近二倍体干系的存在与骨肉瘤临床经过良好有关。应明等对18例骨肉瘤及其他骨肿瘤的研究结果则表明，该组骨肉瘤病例均为DNA异倍体，且有4例出现DNA双干系。认为异常DNA含量是肿瘤恶性的标志，而DNA双干系的出现则是肿瘤高度恶性的特征。最近，VanOvan

报道一病例初诊时经病理学及FCM分析为典型骨旁骨肉瘤，但切除后8个月

,部分肿瘤显示高度恶性特征，FCMDNA分析也发现DNA异倍体。原发瘤切除后1年肺转移。进一步肯定了FCMDNA检测在骨肉瘤生物学行为判断方面的应用价值。Mankin认为，通过一些技术上的改进，FCM在评估骨肉瘤病人预后和评价治疗效果方面具有一定价值。㈡Ewing′s肉瘤Ewing氏肉瘤是儿童期最常见的骨肿瘤之一，恶性程度高，5年生存率只有40%。临床上须与横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤及淋巴肉瘤鉴别。FCM分析表明，多数横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤为DNA异倍体而Ewing氏肉瘤则多为二倍体。Kowal-Vern等以FCM和ICM方法探讨了Ewing氏肉瘤和骨外Ewing氏肉瘤DNA含量、形态学特征、发生部位和生存时间的关系，FCM检测的18例中，12例为二倍体、1例为异倍体、4例为四倍体，另l例不成功，ICM也得出了相似的结果，FCM和ICM两种方法的符合率为75%。作者认为Ewing氏肉瘤的DNA倍体与形态学特征、发生部位和生存时间均无关系。

Diedok对37例Ewing氏肉瘤组织切片进行原位细胞光度测量，26例以Hedley方法进行FCM检测，DNA异倍体肿瘤病人均在最初诊断后5年内死亡，19例正常DNA分布的肿瘤病人中的11例(58%)仍健康生存，平均存活时间是7.5年。在FCM检测显示为正常DNA范围的15例病人中有8例健康生存，平均存活时间8年，因此认为，Ewing氏肉瘤的DNA异倍体与预后有关。此外，ICM和FCM两种方法均是判定Ewing氏肉瘤预后的可靠方法。两种方法相比，细胞光度测量术对判定病人预后方面优于FCM方法。

㈢骨巨细胞瘤骨巨细胞瘤具有局部呈侵袭性生长特征，但由于临床病程变异大，治疗方案的确定往往存在一定困难。Helm对28例骨巨细胞瘤进行了FCMDNA分析，探讨了FCM方法对其诊治的价值。结果发现，治疗类型与骨巨细胞瘤的预后有关，FCMDNA结果无助于骨巨细胞瘤生物学行为的判断。相反，尹格平等对35例骨巨细胞瘤的FCM分析结果显示，所有I级和29.4%的Ⅱ级骨巨细胞瘤为DNA正常倍体，而70.6%Ⅱ级和所有Ⅲ级骨巨细胞瘤为DNA异倍体，认为FCMDNA含量能客观反映肿瘤生物学行为，提示临床预后。不论病理分级如何，良性和低度恶性骨巨细胞瘤为2倍或近二倍体，中度恶性为低异倍体，高度恶性为多倍体或双DNA干系。与病理分级相比FCM可提供肿瘤生物学行为、预后等方面的重要信息。国内另一作者通过对44例骨巨细胞瘤的

FCM分析，发现2例Ⅲ级骨巨细胞瘤均显示DNA异倍体，且1例发生肺转移，而42例Ⅰ和Ⅱ级骨巨细胞瘤中16例为DNA异倍体，细胞增殖活性与DNA异倍体率在Ⅰ和Ⅱ级间无明显差别，但在原发与复发肿瘤间差异显著。因而亦认为，FCMDNA分析有助于常规组织学分型与分级的确定，并可为临床提供预后有关的信息。

㈣软骨肉瘤应明等对11例软骨肉瘤的研究结果亦表明，除1例为二倍体外，其余10例均表现为DNA异倍体，旦多数为低异倍体，因而提出，异常DNA含量是肿瘤恶性的标志，而DNA双干系的出现则是肿瘤高度恶性的特征。国外有学者分别报道了罕见的透明细胞和印戒细胞软骨肉瘤，其FCM分析结果均为DNA异倍体。

elNaggar等学者进行了骨肿瘤FCMDNA/RNA的研究工作。DNA/RNA的FCM定量分析结果表明，与多数DNA研究结果相似，DNA倍体、增殖活性在良恶性骨肿瘤间差别显著，良性肿瘤主要表现为DNA二倍体、低增殖活性，而多数恶性肿瘤则表现为DNA异倍体、高增殖活性。RNA分析结果表明，骨巨细胞瘤、动脉瘤型骨囊肿、软骨母细胞瘤细胞RNA含量高，这有助于此类肿瘤的鉴别诊断。此外，作者还发现，低度恶性肿瘤的增殖活性与临床预后有关。术前治疗明显影响肿瘤增殖活性。可见FCMDNA/RNA分析有助于某些骨肿瘤的鉴别诊断，有助于治疗反应的评价并有助于骨肉瘤生物学行为的判断。

十二流式细胞术在皮肤肿瘤中的应用㈠皮肤肿瘤的应用FCM用于皮肤肿瘤方面，首先用于区分良性肿瘤与恶性肿瘤。如日光性角化病、鲍温样丘彦病、脂溢性角化与皮肤鲍温氏病、鳞状细胞癌及基底细胞癌,色素德与黑色素瘤。皮肤淋巴细胞浸润、皮肤反应性淋巴细胞增生与草样肉芽肿、Sezary综合征。皮肤纤维瘤与纤维肉瘤。良性肿瘤的DNA含量低，恶性肿瘤的DNA含量高。良性肿瘤几乎均为二倍体，恶性肿瘤大多数为异倍体。Barlogic研究5000多例人体肿瘤，发现各种恶性肿瘤的异倍体率为67%-90%。

⒈恶性黑色素瘤与色素痣：恶性黑色素瘤(Malignantmelonamh，MM)是恶性程度非常高的肿瘤，病情进展快，经过各种治疗后，肿瘤仍易复发和转移，生存率低，预后极差

。Hulkrt从曾经研究的71