基因操作与医学课件

2023/7/3010:031第七节基因操作在医学发展中的意义TheSignificanceofGeneManipulatinginMedicalDevelapments江黎明2012年10月基因操作技术在医学方面的价值主要包括：（1）疾病相关基因和疾病分子机制的分析家；（5）高效率、低成本地生产用于疾病防治的生物

活性蛋白质、细胞、器官。（2）建立新的疾病诊断方法--基因诊断；（4）纠正人类基因缺陷的方法--基因治疗；（3）发展出新的法医学鉴定方法--法医学鉴定；2023/7/3010:0322023/7/3010:033一、疾病相关基因分析要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分析基因的结构和疾病状态下基因的突变。

1911年Wilson将红绿色盲基因首次定位到X染色体上，开创了人类基因定位的先河。

1968年Donahue利用系谱分析将Duffy血型基因定位于1号染色体上，这是人类首次将基因定位于常染色体上。2023/7/3010:034

20世纪80年代以前，可进行结构分析的疾病相关基因仅限于个别功能异常非常明确，基因表达产物纯化较易的遗传性疾病，尤其是血液系统疾病如镰刀状贫血、地中海贫血等。

20世纪80年代中期以后，随着分子生物学技术的发展，尤其是重组DNA技术水平的提高和PCR技术的广泛应用，使疾病相关基因的鉴定与克隆工作得以迅速发展。2023/7/3010:035（一）功能性克隆(functionalcloning)——从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病基因。实际上是利用纯化蛋白克隆致病基因。获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种：获取部分氨基酸序列，推导出mRNA序列，合成

寡核苷酸探针，筛选cDNA文库；从基因组文库

获取其基因组序列。

制备特异性抗体，筛选表达型cDNA文库。只要能获得部分氨基酸序列就可以进行基因克隆。2023/7/3010:036根据mRNA表达差异来克隆疾病相关基因：（1）削减杂交(subtractivehybridization)（2）差异显示（differentialdisplay）PCR（3）基于PCR的削减杂交法将正常与异常的同一组织的mRNA或cDNA文库进行杂交，筛选出表达有差异的克隆；能很灵敏地扩增两个mRNA样品中有差异的片段，克隆后进行分析；将前两种方法结合起来，克服了削减杂交灵敏度低，差异显示PCR假阳性高的缺点。2023/7/3010:037缺点：大多数症状的生理、生化变化很复杂，对与之有关的蛋白质了解甚少，对其基因表达主要组织也知之不多。不同组织甚或至于同一组织的蛋白质与mRNA的“正常”差异很难与特异性差异区别。功能性克隆技术成熟、方法直接、费用较低，迄今仍是克隆基因的首选策略。优点：2023/7/3010:038（二）定位克隆（positionalcloning）——从一种致病基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆包含：遗传学分析：分子生物学分析：包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基因的染色体定位；包括染色体异常（缺失、易位等）分析和基因文库的筛选与基因克隆。2023/7/3010:039杜氏肌营养不良(DMD)致病基因的克隆：首先，遗传学的家族连锁分析确定了致病基因位于Xp21（性染色体X短臂第2区第1条带）。将病人的Xp21DNA与正常人的杂交，从而减掉了相同的基因序列，最后剩余的序列即为病人缺失的基因。2023/7/3010:0310新的技术非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)：定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)：直接根据分子病理学变化和基因组作图中各种基因产物功能的了解预测出候选致病基因。一旦致病基因的染色体定位得以确认，可以利用因特网上的基因网站所提供的基因序列数据鉴定出候选致病基因。2023/7/3010:0311（三）基因结构和产物功能的分析——利用对于某基因结构和功能的理解，分析其与疾病的关系、是否有突变、突变产物的致病机制。获得未知基因后可进一步进行下列工作：1．克隆和分析全长cDNA序列：根据cDNA序列推出该基因编码的蛋白质的氨基酸序列；2．克隆基因全序列：分析存在的内含子，启动子以及其调节位点，探讨基因表达调控方式；3．确定基因在的位置和拷贝数：染色体中定位多用原位杂交法，拷贝数可用Southern杂交法确定。2023/7/3010:03124．基因表达谱分析：该基因在不同组织、细胞的表达状态。Northernblotting和点阵杂交检测mRNA的水平。Westernblotting检测蛋白质的表达。5．基因表达产物的功能分析：（1）找已知功能的同源蛋白或同源结构域。（2）在细胞内过量表达该基因，观察各种功能影响。（3）在细胞内抑制该基因表达，分析细胞功能变化；

建立基因剔除小鼠，分析基因产物功能。（4）分析与该基因产物相互作用分子，或者是相互

作用的蛋白分子或核酸。2023/7/3010:0313二、制造生物活性蛋白基因工程技术的发展在医学上最重要的成就表现在治疗用生物活性蛋白或疫苗的生产和使用。通过基因的克隆，可获得具有特定生物学活性的蛋白质。这尤其适用于那些来源特别有限的蛋白质，或自然界本不存在的蛋白质。克隆基因的表达可在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳类细胞或整体动物体内。2023/7/3010:0314生物安全性：活性的可控性：资源和生产成本：未发现诸有如此类猪胰岛素、牛脑垂体提取的生长激素、人血VIII因子的副作用。基因工程产品的可重复性要好于生物提取物。无资源依赖性，生产成本也明显低于生物提取。基因工程产品比生物提取产品有明显的优势：产品名称适应症乙型肝炎表面抗原人胰岛素生长激素组织肝淳蛋白激活物（TPA）α-干扰素β-干扰素γ-干扰素促红细胞生成素（EPO）*粒细胞刺激因子（GSF）粒细胞-巨噬细胞刺激因子（GMSF）*表皮生长因子（EGF）第VIII因子第IX因子白细胞介素2（IL-2）白细胞介素3（IL-3）白细胞介素4（IL-4）干细胞生长因子（SCF）抗CD3抗体CAMPATH-1H（淋巴细胞抗体）抗内毒素抗体抗肿瘤坏死因子抗体注射疫苗用于预防乙型肝炎糖尿病垂体功能低下急性心肌梗塞慢性髓系白血病，骨髓瘤乙型肝炎，艾滋病人并发kaposis肉瘤多发性硬化（试用）抗贫血*肾性贫血化疗后白细胞和内体骨髓移植再生*严重烧伤血友病A，B血友病A，B肿瘤免疫治疗化疗后促进髓母细胞形成免疫缺陷病，肿瘤，免疫佐剂骨髓移植前扩增骨髓干细胞器官移植类风湿性关节炎，非何杰金氏淋巴瘤革兰氏阳性菌感染严重炎症，类风湿性关节炎表7-1临床正在使用或试用的部分基因工程产品2023/7/3010:0315载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定核酸分子杂交法2023/7/3010:0316（一）重组DNA技术是在编码蛋白质基因的特定位置引入碱基替代、产生小的碱基缺失或插入，使其编码的蛋白质的一级结构发生改变。在合成PCR引物时，除了在定点诱变的位置引入相应的突变（点突变、小片段插入或缺失）外，其余序列与模板完全配对

PCR扩增后，产物中就引入特定的突变；将PCR产物克隆表达，可获得定点突变的蛋白质。PCR诱变：2023/7/3010:03171.蛋白质工程中的定点诱变技术

表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的建立和表达产物的分离、纯化等技术和策略。

外源基因表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。表达系统可根据受体细胞的不同分为原核表达系统和真核表达系统。2023/7/3010:03182.目的基因体外表达真核表达载体—大多是穿梭载体含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和MCS等序列；含有真核细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号和PolyA化信号及遗传选择标记等组件。2023/7/3010:0319原核表达载体含有强启动子及其两侧的调控序列，SD序列，带有转录终止序列含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和MCS等序列；（1）目的基因在原核系统中的表达大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产。2023/7/3010:0320在真核细胞中表达外源基因的体系主要有酵母、昆虫细胞（杆状病毒）、哺乳动物和高等植物。2023/7/3010:0321（2）目的基因在真核细胞中的表达瞬时表达（不与宿主染色体整合）常用的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾CV-1细胞的COS细胞。稳定表达（整合至宿主染色体中）常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵巢的CHO细胞。2023/7/3010:0322（二）转基因技术简介转基因技术(transgenictechnique)利用DNA重组技术在动物体内引入可遗传给子代的外源基因的技术。转基因(transgene)：被导入的目的基因MicroinjectionintothePronucleusofaBovineZygote转基因动物(transgenicanimal)：目的基因的受体动物基本原理

采用基因转移技术将目的基因导入受精卵的细胞核内或着床前的胚胎干细胞，然后将细胞导入受体动物子宫，使之发育成个体。

2023/7/3010:0323基因的导入方式：显微注射法(最常用)胚胎干细胞法逆转录病毒感染法2023/7/3010:0324显微注射是最早发展，也是最为有效的外源

基因导入方法。将目的基因直接注射到受精卵内，目的基因即可与

受精卵的染色体整合，最终可产生带有外源基因的

转基因动物。转基因动物发育后，在其体细胞和生殖细胞中都有

外源基因的存在和表达，并可将该基因遗传给子代。可以在携带外源基因的载体内加上组织特异性启动

子，从而在转基因动物体内限定表达外源基因的组

织和器官。显微注射法建立转基因鼠技术路线目的基因供体动物受精卵受体动物输卵管动物幼崽转基因动物微注射移植妊娠出生分子检测2023/7/3010:03251982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超级小鼠”其中有七只带有融合基因，六只生长迅速，每只体重平均可达44g，为同窝无融合基因小鼠平均体重29g的1.5倍。把这种重组的质粒注射入小鼠受精卵中，经过充分发育后分娩出了21小鼠。将大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白基因的启动子顺序连接，再引入质粒中。转基因小鼠正常小鼠2023/7/3010:03262000年法国科学家“制造”出发出绿色荧光的兔子“Alba”。改造水母的荧光蛋白基因使荧光蛋白发光率提高了2倍，再将该基因显微注射转入到兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。在普通光线下它看上去与其它同类没有区别，但在较暗光线下它的身体就会放射出奇异的绿光。2023/7/3010:0327乳腺生物反应器的诞生

据推测，2010年世界上采用动物乳腺生物反应器生产的年产超过了500亿美元。

1987年Gordon等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清蛋白基因的启动子构成重组基因，培育出了37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠。2023/7/3010:0328动物多肽药物用途绵羊a1抗胰蛋白酶蛋白治疗气肿绵羊CFTR治疗囊肿性纤维化绵羊组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓绵羊凝血VIII因子、IX因子治疗血友病绵羊纤维蛋白原伤口愈合猪组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓猪凝血VIII因子、IX因子治疗血友病山羊人蛋白质C治疗血栓山羊抗血栓因子3治疗血栓山羊谷氨酸脱羧酶治疗I型糖尿病山羊Pro542治疗爱滋病牛a-乳清白蛋白抗炎症牛凝血VIII因子治疗血友病牛纤维蛋白原伤口愈合牛胶原蛋白I,II组织修复,治疗风湿性关节炎牛乳铁蛋白治疗肠道感染,感染性关节炎牛人血清白蛋白维护血液体积鸡,牛,山羊单克隆抗体用于疫苗生产2023/7/3010:03292023/7/3010:0330显微注射法等传统的转基因技术具有随机性和不可预见性、整合率、表达低等式缺陷。外源基因的拷贝数和整合位点都是随机的；小鼠,大鼠,兔,牛,猪,绵羊阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。

整合率极低，得到的转基因动物数量更少。采用非受精卵还出现嵌合体；受到宿主染色体上整合位点的影响，大部分转

基因表达水平较低。2023/7/3010:0331

即体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。2023/7/3010:0332

核转移技术可使一个细胞变成一个个体，所产生的个体携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖过程，即克隆(clone)。（三）核转移技术简介2023/7/3010:03331.动物克隆——转移的核末经修饰2023/7/3010:03342023/7/3010:0335多利羊诞生于1996年7月5日，1997年首次向公众披露。被美国《科学》杂志评为1997年世界十大科技进步的第一项，也是当年最引人注目的国际新闻之一。科学家认为，“多利”的诞生标志着生物技术新时代的来临。1997年2月27日《Nature》报道，维尔穆特(Wilmut)和坎贝尔(Campbell)利用克隆技术培育出一只小母羊。2023/7/3010:0336坎贝尔利用克隆多利时冷冻保存下来的，同一只母羊乳腺组织样本，克隆出“多利四羊组”。转基因动物可以作为天然的生物工厂，合成多肽和蛋白质等生物活性物质，制备药物、抗体和疫苗等，称为动物生物反应器(animalbioreactor)。生物药物生产主要通过乳腺生产(动物乳腺生物反应器)，少数通过肾脏和膀胱。用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。2.转基因动物生物反应器的制备—转移的核经过修饰2023/7/3010:03372023/7/3010:03381997年6月伊恩·维尔穆特(Wilmut)报道用基因改造过的胎儿成纤维细胞为核供体，获得了表达人凝血因子IX的转基因克隆绵羊“波莉”。成功克隆出携带有人凝血因子ＩX基因的绵羊早期

胚胎成纤维细胞；以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经

过处理后将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育。获得3只能高水平表达人凝血因子ＩX（125μg/ml）

的绵羊。

人体移植器官短缺是一个世界性难题，研究人员把目光移向动物以寻求可替代移植器官。

猪器官的体积、形状和DNA基本与人类相似，是理想的器官供应者，但这种器官移植的主要问题之一是免疫排斥。三、制造用于移植的细胞、组织和器官2023/7/3010:0339解决办法之一：通过转基因技术，特别是基因打靶技术：敲除α-半乳糖抗原决定基因，再结合克隆技术，培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪的器官。向供体器官基因组敲入某种调节因子，抑制α-半乳糖抗原决定基因的表达；2023/7/3010:03402023/7/3010:0341（一）基因打靶技术简介可在细胞水平进行，从而建立新的细胞系；也可在动物整体水平进行，以建立基因剔除动物。

基因打靶(Genetargeting)，是一种在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上，定向改变生物体内某种基因的技术。基因敲除(geneknockout)：定向敲除某种基因基因敲入(geneknockin)：定向替代某种基因2023/7/3010:0342基本过程包括：①用同源基因片段构建含有目的基因的载体；②用显微注射法将含有目的基因的载体导入ES细胞，

与ES细胞染色体的相应基因发生同源重组，替代ES细胞中原有的基因；③将基因替代了的ES细胞注入动物的囊胚中，使其

与囊胚中的细胞共同组成囊胚内的细胞团；④将囊胚移植到假孕动物的子宫中，使之发育成一

种既有含目的基因细胞又有原有细胞的嵌合体；⑤将嵌合体动物与正常动物交配，最终筛选出基因替代的纯合子动物。跨物种感染：一般不会感染人的病毒，通过异种器官移植提供的种间细胞亲密接触，可能感染人或者与人的病毒重组形成更危险更致命的病毒，而且免疫系统受到抑制的移植受体比一般人更容易被感染。更加重要的是，转基因动物带的未知病毒是否会从移植受体扩散出去，从而传播到其他人造成疫病大流行，引起流行病？风险2023/7/3010:0343组织工程

是利用人体自身细胞和组织工程的理论与方法，使原先缺损的组织和器官沿着设计好的支架、模型顺其自然地成长起来发。2023/7/3010:0344多能干细胞的定向分化2006年，京都大学的山中伸弥(ShinyaYamanaka)从24个候基因中筛选出4个与胚胎干细胞多能性更为密切相关的基因：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态。将它们导入到小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞，成功地将其重编程为具有胚胎干细胞多能性的细胞，称之为诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell,iPScell)

。（二）诱导产生的多功能性干细胞技术2023/7/3010:03451.Oct3/4Oct-4，也称Oct-3，属于POU转录因子家族的一员。是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子。是全能性的标志；能够促使ICM形成、维持胚胎干细胞未分化前状态，并促进其增殖。2023/7/3010:03462.SOX2基因SOX2基因是编码转录因子的主控基因（mastergenes）家族的一个成员。转录因子是些与DNA结合并调节其他基因表达的蛋白质。2023/7/3010:03473.癌症基因c-MYC癌症基因c-MYC，是一种最容易过渡表现于人类的致癌基因，它对某些成体干细胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES细胞的分化。2023/7/3010:03484.Klf4Krueppel-likefactor4，KLF4上皮锌指转录因子Klf4(旧称GKLF)

调节体外细胞的增生与分化。2023/7/3010:0349诱导式多能性干细胞实验流程式2023/7/3010:0350制定治疗用iPS实验流程2023/7/3010:0351

2006年11月20日，日本京都大学的山中伸弥(ShinyaYamanaka)在《Cell》