2021年植物中SOD的分离提取及性质研究实验报告

植物中SOD分离提取及性

质研究综合试验汇报学校：学院：班级：同组组员：一、试验目SOD广泛存在生物界，是防御氧毒害关键酶。SOD关键有CuZn-,Mn-,Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同生物学作用是专一清除氧化中产生超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器,尤其是生物膜有严重损坏作用），含有抗衰老,抗辐射,抗癌等生理作用。在医药中,SOD可用于诊疗辐射病，本身免疫性疾病,炎症等;在食品中，可用于保健食品添加剂;在化妆品中，可预防皮肤衰老抗炎,防晒等作用。植物中大蒜SOD含量丰富,所以,本试验研究大蒜中SOD性质，而且确定SOD同工酶类型。依据SOD性质,我们采取邻苯三酚自氧化法判定同工酶最适温度,最适PH,以及双氧水对酶活力抑制。并采取改善自氧化法测酶活力.二、试验原理1、 邻苯三酚自氧化法依据国际酶学委员会要求，酶比活性（specificactivity）用每mg蛋白质含有酶活性单位（UEg蛋白）来表示。所以,测定样品比活性必需测定:每mL样品中蛋白质mg数（mg/mL）^ml样品中酶活性单位数（USL）。酶纯度越高酶活性也就越高。SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄瞟吟氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。在通常情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本试验采取邻苯三酚自氧化法测定。利用邻苯三酚在碱性条件下能快速自氧化，释放出O-,2生成带色中间产物。反应幵始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度,在325nm处测定溶液吸光度。酶活性单位采取1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时酶定量为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度升高而增加2、 不连续电泳不连续电泳是指使用不一样孔径和不一样缓冲系统电泳。因为浓缩胶堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）凝胶上进行分离。因为不一样孔径凝胶分子筛作用，使不连续电泳分辨率大大高于连续电泳。即使不连续电泳在缓冲系统选择和制胶（尤其是梯度胶）操作方面比较繁杂，但它能够得到电泳分离最关键指标--高分辨，所以是现在应用最广泛技术。三、试验试剂大蒜、氯仿-乙醇混合液、维生素I、冷丙酮、邻苯三酚、浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N*,N*-四甲基乙二胺。）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、漠酚蓝、5.0mol/LPH7.8磷酸钠、10mmol/LHCl、Tris（三羟甲基氨基甲烷；氨基丁三醇）、甘氨酸2.45mol/LNBT溶液:称取200mgNBT溶于蒸馏水中并定容至100ml置棕色试剂瓶中，避光贮存。3.60mol/LPH7.8磷酸缓）中液（内含2.8mol/LTEMED和2.8维生素）：1；在100ml3.60mol/LPH7.8磷酸钠缓中液中加0.42mlTEMED及1.32mg维生素，置棕色瓶中贮存。PH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液:称取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加水至1000ml,用是加水稀释10倍。PH8.91.5mol/LTris-HCl缓冲液:称取18.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris）加24ml 1mol/L盐酸,加水至100ml.PH6.8O.5mol/LTris-HCl缓冲液:称取Tris6.0g,加48ml1.Omol/L盐酸溶液100mlo以及不一样浓度磷酸缓冲液。0.05mol/L,PH以下5.86.57.07.37.67.87.98.3凝胶贮液以及凝胶A液：48mllmol/LHcl,36gTris,0.24mlTEMED.B液：48ml lmol/LHcl,5.9gTris,0.46mlTEMEDOC液： 30gAcr,0.8gBisD液：lOgAcr,2.5gBisE液：4mg核黄素F液：40g蔗糖（以上各液定容至100ml）凝胶（体积比）：A:C:E:水=1:3:1:3浓缩液（体积比）：B:D:E:F=1:3:1:3四、试验仪器离心机离心管水浴锅电热炉研钵移液枪移液管胶头滴管试管若干721型分光光度计以及紫外分光光度计DYCZ-240D型垂直板电泳槽锥形瓶冰箱不一样型号容量瓶若干托盘天平烧杯玻璃棒试验内容制备酶液：SOD提取：称取20~25g大蒜蒜瓣，置于研磨器中研磨，使组织细胞破碎。再加入2~3倍体积0.05mol/LPH7.8磷酸缓冲液，继续研磨,搅拌20min,使SOD充足溶解到缓冲液中，然后以5000r/min离心15min，弃去沉淀，得提取液。（留取1ml提取液备用,正确量取剩下上清液体积,统计）除杂蛋白向提取液中加入0.25倍体积氯仿-乙醇混合液，搅拌15min,5000r/min,离心15min,弃除杂蛋白，得粗酶液。（留取1ml粗酶液备用，正确量取剩下粗酶液体积,统计）SOD沉淀分离将上述粗酶液加入等体积冷丙酮，搅拌15min,5000r/min,离心15min得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/LPH7.8磷酸缓冲液中，于55~60°C热处理15min,再离心弃沉淀得SOD酶液（留取1ml酶液备用，正确量取剩下酶液体积，统计）②SOD性质测定：粗酶液活性测定（邻苯三酚法）试剂ml空白管对照管提取液粗酶液酶液PH8.3磷酸缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7

室温放置20min反邻苯三酚00.20.20.20.2吸光值加入邻本三酚后应，在420nm下）-快速混匀,丄则定吸光值。F确计时4min,加滴浓Hcl停止酶母液取适温度探究■ 试管试剂『mi、——1-^————2号————3^————4-号————5-号——温度处理（Jd口a口A米而会厶铲巾0255075100rHo.3磷酸缓/屮液33333SOD酶0.1。0.1。0.1。0.1。0.1。液蒸馏22222水 在各自温度下静置10min，然后取出ncncncncnc邻本三酚吸光值加入邻苯三酚后快速混匀，正确计时4min,加一滴浓Hcl停止反应，在420nm[6]下测定吸光值。土酶液取适PH探试髦究123456试剂mlSOD酶液磷酸缓冲液0.15.00.16.50.17.00.17.30.17.60.17.9(PH)ccccc蒸馏水222222△[7 3KA在取适温AC度下,水浴1AC0min，取出ACACACAC邻本三酚0.20.20.20.20.20.2吸光值4.抑制剂对酶液活性影响对SOD活力抑制试管试齐1」mi-15%、1234H2O215卩120卩125uT30ulSOD酶液0.10.1L0J0.1于30°C水浴恒温30min,取出快速冷却至25°C邻苯三酚0.20.20.20.2吸光值③同工酶类型判定：（不连续电泳）将玻璃板用蒸憎水洗净晾干,准备2个洁净锥形瓶.把玻璃板在灌胶支架上固定好固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，预防夹坏玻璃板.按百分比配好分离胶，用移液管快速加入，大约5厘米左右，以后加少许蒸憎水，静置40分钟.凝胶配制过程要快速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，不然凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡.水封目是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气,凝胶聚合好标志是胶与水层之间形成清楚界面.倒出水并用滤纸把剩下水分吸干，按百分比配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，快速插入样梳，静置40分钟.样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡,梳底需水平.在上槽内加入缓冲液后，拔出样梳•要使锯齿孔内气泡全部排出，不然会影响加样效果.加样，取10u1样品溶液再加入10ul2倍样品缓冲液，上样量分别为5u1和3ul.按下表用微量注射器距槽底三分之一处加样,加样前，样品在沸水中加热3分钟,去掉可稳态聚合.（注射器不可过低，以防刺破胶体,也不可过高，在样下沉时会发生扩散.为避免边缘效应，最好选择中部孔注样.）槽口12345试剂SO酶液D和SOD酶液SO酶液D和h2o2SOD酶液SOD酶液1234512345电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA,当进入分离胶后改为20mA，漠酚蓝距凝胶边缘约5mm时,停止电泳.SOD活性染色取凝胶板，按下列次序浸泡于培养皿中染色2.45mol/LNBT溶液中,再黑暗制牛下浸泡20min，NBT溶液应置于暗处,4贮存以免氧化变质，染色时也至于暗处，如凝胶板厚可延长浸泡时间置于3.60mol/LPH7.8磷酸缓冲液（内含2.8mol/LTEMED和2.8维生素I；）中，在黑暗条件下浸泡15min将凝胶板移入5.0mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液中浸泡，在4〜W日光灯下照20-30min,光照应均匀，使无SOD区NBT充足还原成蓝紫色甲月替。经上述染色和光照后凝胶板，在蓝色背景

④酶活力测定:上出现清楚透明SOD活性染色。染色后凝胶板用水漂洗数次后,再用保留液浸泡。④酶活力测定:⑴邻苯三酚自氧化速率测定:在试管中加入缓冲液4.5ml,于25保温20min，然后加入预热邻苯三酚10pL（对照管用10mmol/LHCl替换）,快速摇匀倒入1cm光径比色皿在325nm下,每隔30s测吸光度一次，可合适调整邻苯三酚加入量，将自氧化速率控制在0.070A/min.⑵SOD或粗酶液活性测定:在试管中加入约10卩l酶夜，其它操作同自氧化速率测定，按下列公式计算酶活力：0.070-样液速率0.070单位体积活力（U/ml） 两 x反应液总体积总活力单位数（U）=每毫升酶夜活力单位x酶夜总体数积六、 要求利用试验技术高速离心技术、有机溶剂沉淀技术、分光光度技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术等。七、 试验结果与讨论试验结果统计：粗酶液活性测定（邻苯三酚法）

试剂ml空白管对照管提取液粗酶液酶液PH8.3磷酸缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2平均吸光值00.2630.2500.2450.217粗酶液试验结果分析：依据邻苯三酚法测定酶活力一号管作为空白管，在试验中起对照作用。二号管作为对照管，加入了邻苯三酚。三、四、五号试管吸光度依次下降且均低于对照管，表示酶活力依次增强。且酶液活力远高于粗酶液。

酶母液取适温度探究酶液的最适温度探究0.9酶液的最适温度探究0.90.80.7//值0.6光0.5吸-均°.4平0.302 」 70.1111101号2号 3号4号 5号试管平均吸光值\_(A 八试管试疝地\2-号3号4-号 5号 温度处理q)CVYCC工习二弥厶厶E\H-l0255075100PH8.3磷酸缓冲液33333SOD酶0.10.10.10.10.1液蒸馏22222水在各自温度下静置10min，然后取出邻本三酚0.20.20.20.20.2平均吸光值0.2000.4950.3490.2280.850验结果分析:试验中米取单一变量方法，严格控制五支试管中除温度单一变量不一样外其实试验变量完全相同，能够有效验证sod酶最适温度。其中取五个温度梯度,分别为0°C,25°C,50°C,75°C,100°C,其中OP吸光光度值为最低,经验证为试验错误。从25C到75C，伴随温度升高,吸光光度值依次降低，证实在一

定范围内，伴随温度升高，酶活性升高。在75°C达成活性最高点（研究范围内）试管酶液的最适PH探而从75C和100C数据中能够看出，吸光光度值升高，说明了此时sod酶已经失活，无法催化。在此范围内，得出酶最适温度为75C试管酶液的最适PH探酶液最适PH探究试管试剂wl.123456SOD酶液0.10.10.10.10.10.1磷酸缓冲液（PH）5.86.57.07.37.67.9蒸馏水222222在最适温度下，水浴10min,取出邻苯三酚0.20.20.20.20.20.2平均吸光值0.3610.2510.1460.1050.0650.1500.40.350.3值光吸均平0.25值光吸均平0.2平均吸光值0.15平均吸光值0.10.050验结果分析:一样,在探究sod酶最适ph我们依旧采取为控制变量法。除ph以外试验变量控制保持不变,而且使温度保持在最适温度即75°C反应，能够有效排除其它外界原因对于试验结果干扰。可看出,ph对于sod酶活性影响显著，且在碱性环境中,sod酶活性较强，在ph=7.6时,吸光光度值达成了最大，说明酶活性最强。单一变量法探究除了sod酶最适ph为7.6。4•抑制剂对酶液活性影响⑴h.q对SOD活力抑制、***试管试剂12341.5%H2O215卩1C120卩1C125uL30ulSOD酶液0.10.10.10.1于30C水浴恒温30min,取出快速冷却至25C邻苯三酚0.20.20.20.2平均吸光值0.4030.4050.4370.4280.44平均吸光值0.44平均吸光值0.430.42— 平均吸光值— 平均吸光值0.40.39 0.38 1 1 1号 2号 3号 4号试验结果分析:一样米取控制变量法，此处我们控制单一变量为抑制剂物质量。其中抑制剂为过氧化氢，显然，由试验数据可得，抑制剂过氧化氢对酶活有一定抑制作用，使酶活力降低。降低程度与抑制剂物质量相关。一定程度内，物质量越大，抑制程度越深，不过25卩1时酶活力低于30卩1时酶活力,说明过量抑制剂反而无法高效抑制，在25卩1时效果最好。相关聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析：试验中，我们根据步骤严格配比出了凝胶液，浓缩液，并根据步骤加入浓缩胶，插入梳子。取梳齿距密集小梳子，使最终凝胶制作完成时，各个加样处距离分布密集。同时，当我们加样时，未能立刻准备将粗酶液加入各个槽中，使得最终凝胶电泳时，